王國(guó)芬 李超萍 時(shí)濤 周司珊 李博勛 蔡吉苗 林兆威 黃貴修

摘? 要：為明確國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒?。╟assava mosaic virus disease）的危害情況、田間癥狀及其病原類(lèi)型，本研究于2018—2019年調(diào)查了該病在國(guó)內(nèi)的分布情況、癥狀特征及種質(zhì)來(lái)源等數(shù)據(jù)，采集了8?。▍^(qū)）19地的384份樣品，利用特異性引物檢測(cè)2種木薯花葉病毒侵染引起的癥狀類(lèi)型，并通過(guò)序列比對(duì)明確其病原特點(diǎn)。結(jié)果表明：木薯花葉病毒病已經(jīng)在我國(guó)發(fā)生，種莖調(diào)運(yùn)是該病遠(yuǎn)距離傳播的主要原因;國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒病病原有斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）和木薯普通花葉病毒（Cassava common mosaic virus， CsCMV）2種病毒，可分為單獨(dú)感染、復(fù)合感染，其中SLCMV的檢出率為21.1%，CsCMV的檢出率為36.5%，SLCMV-CsCMV復(fù)合侵染率為15.1%;檢測(cè)到的SLVMV與東南亞SLCMV序列同源性為99.4%～99.7%，檢測(cè)到的CsCMV與拉丁美洲的CsCMV序列相似性為91%～96%。推測(cè)國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒病主要由2種病毒侵染引起，且普通花葉病毒有產(chǎn)生序列變異的可能性。

關(guān)鍵詞：木薯;斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）;木薯普通花葉病毒（CsCMV）;檢測(cè);復(fù)合侵染

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.33????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Distribution and Pathogen Detection of Cassava Mosaic Virus Disease in China

WANG Guofen1， LI Chaoping1， SHI Tao1， ZHOU Sishan2， LI Boxun1， CAI Jimiao1， LIN Zhaowei1，

HUANG Guixiu1

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， China / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： To clarify the disease situation， symptom types and pathogens of cassava mosaic virus disease in China， 19 locations in 8 provinces were investigated in 2018-2019， and 384 narcissus samples were collected. Data analysis results showed that cassava mosaic virus disease had already occurred in China Stem transportation was the main reason for the long-distance transmission of the disease. Specific primers of Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV） and Cassava common mosaic virus （CsCMV） were used to detect the 384 samples. The results showed that SLCMV and CsCMV were detected in 21.1% and 36.5% samples， respectively. 15.1% samples were mix-infected by the two viruses. The sequence similarity between the detected SLVMV and Southeast Asian SLCMV was 99.4%-99.7%， and the sequence similarity between CsCMV and Latin America was 91%-96%. It indicates that domestic cassava mosaic disease is mainly caused by these two viruses， and the Common mosaic virus may have some sequence mutation.

Keywords： Manihot esculenta; Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV）; Cassava common mosaic virus （CsCMV）; detection; mixed infection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.023

木薯（Manihot esculenta）為大戟科多年生作物，主要種植在熱帶亞熱帶國(guó)家和地區(qū)，是世界上第六大糧食作物，在我國(guó)華南及中部多個(gè)省（區(qū)）都有種植，相關(guān)產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。木薯花葉病毒病對(duì)木薯產(chǎn)業(yè)具有毀滅性危害，全球范圍內(nèi)每年因花葉病影響可造成2500萬(wàn)t木薯產(chǎn)量損失，影響到5億多人口的糧食安全[1]。20世紀(jì)90年代，木薯花葉病毒病在烏干達(dá)大爆發(fā)，許多地區(qū)的種植戶(hù)被迫放棄種植木薯[2]。Thresh等[3]估算非洲地區(qū)花葉病發(fā)生后，田間病株平均產(chǎn)量約損失30%～40%，產(chǎn)量損失最高達(dá)86%。2015年，由斯里蘭卡木薯花葉病毒株系引起的花葉病在柬埔寨東部和越南南部交界地區(qū)發(fā)生并迅速向周邊地區(qū)蔓延[4]，2018年6月，相繼在柬埔寨、越南和泰國(guó)的多個(gè)省都發(fā)現(xiàn)了該病的危害[5]。3 a內(nèi)，病害從柬埔寨東部桔井省和上丁省的單個(gè)種植園，發(fā)展到了覆蓋該地區(qū)及其周邊10%的種植地。受病害影響，柬埔寨2017年鮮薯價(jià)格比2016年漲了2～3倍，但單產(chǎn)從2016年的18 t/hm2，減至2017年的15 t/hm2[6]。我國(guó)已將非洲木薯花葉病毒列入進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄[7]，2018年8月，木薯花葉病毒病在我國(guó)海南、福建發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[8-9]。該病傳播速度快，對(duì)木薯產(chǎn)業(yè)危害嚴(yán)重，病害在國(guó)內(nèi)的發(fā)生，立即引起了國(guó)內(nèi)木薯主產(chǎn)區(qū)薯農(nóng)及科研人員的高度重視。

世界范圍內(nèi)，木薯的重要病毒病主要有3個(gè)類(lèi)群：第一種為雙生病毒引起的木薯雙生病毒花葉?。╟assava mosaic disease， CMD），病原為聯(lián)體病毒科（Geminivieidae），菜豆金黃色花葉病毒（Begomovirus）;第二種為甘薯病毒引起的木薯褐條病（cassava brown streak disease， CBSD），病原為馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae），甘薯病毒（Ipomovirus）;第三種為馬鈴薯X病毒引起的木薯普通花葉病（cassava common mosaic disease， CsCMD），病原為馬鈴薯X病毒組（Potexvirus），馬鈴薯X病毒（Potato virus X）。在東南亞及國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的重大危險(xiǎn)性入侵木薯花葉病毒病，主要為第一種類(lèi)型，由雙生病毒引起的木薯花葉病毒病，強(qiáng)致病株系為斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）;木薯褐條病目前僅在非洲中東部地區(qū)危害[10];多年來(lái)，木薯普通花葉病毒?。–sCMD）僅在拉丁美洲發(fā)現(xiàn)，我國(guó)臺(tái)灣于1981年有過(guò)報(bào)道[11]。

為進(jìn)一步明確引起國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒病的病毒種類(lèi)及其危害情況，2018—2019年，本團(tuán)隊(duì)研究人員集中對(duì)國(guó)內(nèi)木薯主栽區(qū)的木薯花葉病毒病疫情進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)病毒株系進(jìn)行鑒定，為明確國(guó)內(nèi)花葉病種類(lèi)，提高木薯病毒病的監(jiān)測(cè)預(yù)警，避免罹病種莖的調(diào)運(yùn)，保證木薯的健康生產(chǎn)提供必要的檢測(cè)技術(shù)。

1? 材料與方法

1.1? 田間調(diào)查和樣品采集

參考《外來(lái)入侵物種普查及其安全性考察技術(shù)方案》中的病害田間調(diào)查方法，于2018年8月至2019年8月，分別對(duì)我國(guó)海南、廣東、廣西、福建、江西、湖南、貴州和云南8省（區(qū)）的19個(gè)木薯品種或種質(zhì)保存基地進(jìn)行調(diào)查，同時(shí)對(duì)廣西2地農(nóng)戶(hù)自行種植地進(jìn)行考察。實(shí)地監(jiān)測(cè)木薯葉片是否黃化、花葉、皺縮、褪綠，大小是否有變化，植株是否矮化等;對(duì)各地木薯花葉病突發(fā)原因進(jìn)行調(diào)查，走訪種莖來(lái)源，調(diào)查病害發(fā)生時(shí)間和對(duì)可能傳入的途徑進(jìn)行分析。

采集樣品384份，分批整理后保存于–80 ℃冰箱中備用，陽(yáng)性對(duì)照為帶有目標(biāo)病毒核酸序列的質(zhì)粒，健康對(duì)照為防蟲(chóng)溫室培育的健康木薯葉片。

1.2? 改良CTAB一步法制備核酸

所有的試劑、槍頭及EP管均需RNAase處理。取50～100 mg幼嫩葉片，在液氮中研磨成粉末，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB-巰基乙醇緩沖液600 μL（2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris- HCl 8.0，1.4 mol/L NaCl，1% PVP40，使用前加入20%β-巰基乙醇），充分震蕩混勻;65 ℃水浴鍋中恒溫水浴30～60 min;12 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)2次600 μL氯仿萃取后，加入等體積預(yù)冷異丙醇，于4 ℃冰箱沉淀核酸30 min;離心，用1 mL預(yù)冷70%乙醇清洗2次，干燥后的核酸用無(wú)RNAase的ddH2O充分溶解，進(jìn)行電泳及濃度檢測(cè)后分裝，一部分直接用于PCR，另一部分進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。DNA及cDNA于–20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 引物設(shè)計(jì)與合成

煙粉虱傳雙生病毒簡(jiǎn)并引物PA/PB[12]，擴(kuò)增雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白保守區(qū)域，目的片段約500 bp，用于粉虱傳雙生病毒引起的木薯花葉病病原檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[8]合成斯里蘭卡木薯花葉病毒DNA-A特異引物AF/AR，并通過(guò)合成背靠背引物擴(kuò)增DNA-A全長(zhǎng)序列，合成斯里蘭卡木薯花葉病毒DNA-B特異引物BF/BR，擴(kuò)增雙生病毒DNA-B組份;參考文獻(xiàn)[13]合成普通木薯普通花葉病毒特異引物CsCMV-3269-F/CsCMV- 3896-R，各引物序列見(jiàn)表1。所有引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1.4? 病毒檢測(cè)

1.4.1? SLCMV檢測(cè)? 先通過(guò)雙生病毒的通用簡(jiǎn)并引物PA/PB對(duì)檢測(cè)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用SLCMV DNA-A特異性引物AF/AR和SLCMV DNA-B鏈特異引物BF/BR進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.2? CsCMV檢測(cè)? 按照cDNA試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存，用RNA病毒特異性引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件及PCR體系均參考文獻(xiàn)[8， 12-13]的方法進(jìn)行。

1.5? 序列分析

以上PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖（1.0×TAE）電泳檢測(cè)，BioRad凝膠成像儀觀察，記錄結(jié)果。選擇代表性樣品進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行分析。序列的編輯和分析借助DNAMAN 8、DNAStarLasergene 7.1和MEGA 7.0等3個(gè)軟件完成。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 國(guó)內(nèi)木薯花葉病的分布情況

目前國(guó)內(nèi)已審定的木薯品種共36個(gè)，各地保存的木薯材料多為各屬地保存、引進(jìn)或者通過(guò)多種途徑創(chuàng)制的種質(zhì)材料，尚未進(jìn)行審定，以統(tǒng)一的字母或者編號(hào)區(qū)分種質(zhì)來(lái)源，一般情況下各地種植的種質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)大于品種數(shù)量。本研究調(diào)查統(tǒng)計(jì)了各種植區(qū)（地）出現(xiàn)花葉癥狀的木薯品種（種質(zhì)）（表2），從數(shù)量上看，2018年和2019年的品種（種質(zhì)）發(fā)病率分別為5.2%和9.4%，廣西貴港、北海和海南白沙2018年尚未發(fā)現(xiàn)感病植株，2019年由于種植了從發(fā)病區(qū)調(diào)運(yùn)的種莖，導(dǎo)致病害發(fā)生;品種（種質(zhì)）上看，主栽品種出現(xiàn)了花葉癥狀植株，2018年調(diào)查的7省13地，感病的主栽品種有‘華南9號(hào)和‘南植199，其他新種質(zhì)如P系列、‘27-4和‘39-2等;2019年調(diào)查的8省19地，顯癥植株包括2018年的所有已知品種和新引進(jìn)食用品種TCGRI系列。調(diào)查中，農(nóng)戶(hù)的種植地（表中編號(hào)20和編號(hào)21）均無(wú)木薯花葉病毒病顯癥植株，木薯花葉病毒病還僅發(fā)生于調(diào)查所涉及到的品種（種質(zhì)）保存基地。

2.2? 國(guó)內(nèi)木薯花葉病的癥狀類(lèi)型

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)花葉病癥狀的木薯植株，可分為3種癥狀類(lèi)型：第一種表現(xiàn)為葉片皺縮畸形，植株矮化，感病植株首先在葉片上出現(xiàn)褪綠的小斑點(diǎn)，隨后逐漸擴(kuò)大并與正常綠色形成典型花葉狀，受侵染葉片背面有時(shí)可見(jiàn)突起，葉片普遍變小，葉片中部和基部常收縮成蕨葉狀（圖1A）;第二種表現(xiàn)為葉片花葉變形，植株矮化，感病植株首先在嫩葉上出現(xiàn)典型花葉，逐漸在老葉及整株葉片上形成花葉癥狀（圖1B）;第三種表現(xiàn)為植株嫩葉褪綠、花葉癥狀，葉片以褪綠的小斑點(diǎn)向外蔓延，邊界不清晰，大部分僅在上層葉片表現(xiàn)癥狀，不影響植株生長(zhǎng)（圖1C）。

在氣溫較低的冷涼地區(qū)，第一、第二種癥狀的植株呈現(xiàn)典型花葉或畸形癥狀后，長(zhǎng)勢(shì)嚴(yán)重削弱，葉片皺縮且不能正常展開(kāi)，植株常矮化，不能正常結(jié)薯，嚴(yán)重時(shí)整株枯萎死亡。海南、廣西等地區(qū)，春季和秋末季節(jié)氣溫較低，植株的“花葉”癥狀明顯，夏天封行以后，葉片上的花葉癥狀減弱，可能是由于高溫天氣不利于癥狀的形成，生長(zhǎng)中后期由于氣溫下降，受侵染植株癥狀會(huì)再度呈現(xiàn)。

2.3? 木薯花葉病毒的檢測(cè)及其感染情況

將3種花葉癥狀類(lèi)型的木薯葉片分別進(jìn)行總核酸提取，用SLCMV和CsCMV特異引物進(jìn)行PCR及RT-PCR擴(kuò)增，以含有病毒序列的載體作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明，與Wang等[8]的結(jié)果一致，雙生病毒的通用引物PA/PB對(duì)木薯花葉病毒無(wú)有效的擴(kuò)增條帶。第一種癥狀類(lèi)型樣品僅能擴(kuò)增到SLCMV的特異條帶，引物AF/AR-PCR產(chǎn)物大小0.7 kb（圖2A），無(wú)CsCMV的擴(kuò)增片段，表明該癥狀類(lèi)型由斯里蘭卡木薯花葉病毒株系單獨(dú)感染引起;第二種癥狀類(lèi)型，表現(xiàn)出葉片花葉和植株矮化的樣品不僅能擴(kuò)增到SLCMV的特異性條帶，也能擴(kuò)增到CsCMV的特異片段，表明該種癥狀類(lèi)型由斯里蘭卡木薯花葉病毒和木薯普通花葉病毒2個(gè)株系復(fù)合感染引起;第三種癥狀類(lèi)型（圖2B），僅出現(xiàn)葉片花葉褪綠癥狀的植株樣品，無(wú)SLCMV擴(kuò)增產(chǎn)物，只能擴(kuò)增到CsCMV的特異性片段，引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R產(chǎn)物大小0.6 kb，表明該類(lèi)型由木薯普通花葉病毒株系侵染形成。與斯里蘭卡木薯花葉病毒侵染形成的典型花葉癥狀相比，普通木薯花葉病毒株系病葉上“正常綠色”部分和“變色或黃化”部位之間界限不清晰，葉片無(wú)皺縮變形。

在2018年和2019年的384份測(cè)試樣品中，斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（SLCMV）單獨(dú)侵染的檢出率為21.1%，分別來(lái)自海南、廣東、云南、廣西、貴州和福建6個(gè)?。▍^(qū)）的樣品;木薯普通花葉病毒（CsCMV）單獨(dú)侵染的檢出率為78.8%，包括所有8個(gè)?。▍^(qū)）的樣品;SLCMV-CsCMV復(fù)合侵染率為33.0%，主要來(lái)自海南、廣西、廣東和貴州4個(gè)?。▍^(qū)）的樣品。由表3所示，CsCMV的檢測(cè)僅隨機(jī)選取了其中的179個(gè)樣品，其感染率為78.8%，其中2019年每個(gè)采樣點(diǎn)均只隨機(jī)選取了3個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，只有1個(gè)為陰性，其余樣品均為陽(yáng)性，據(jù)此推測(cè)若是將所有的樣品進(jìn)行檢測(cè)，CsCMV的感染應(yīng)該是普遍存在的。

2.4? 木薯花葉病毒的鑒定

選取2019年海南儋州（DG1922）和貴州望謨（GZ1924）2個(gè)斯里蘭卡木薯病毒陽(yáng)性檢測(cè)樣品，經(jīng)測(cè)序獲得DNA-A和DNA-B全基因組序列，在Genbank的登錄號(hào)為MN688214-MN688217。經(jīng)BLAST比對(duì)表明，DG1922和GZ1924的DNA-A序列與已經(jīng)報(bào)道的斯里蘭卡木薯病毒株系柬埔寨分離物SLCMV-Cambodia（KT861468）[4]、越南分離物SLCMV-VTN6（LC312131）[14]、泰國(guó)分離物SLCMV-Surin1（MN544647）和中國(guó)分離物SLCMV-HN7（MH891840）[8]的序列同源性都在99%以上。為進(jìn)一步明確國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒的歸類(lèi)，從Genbank下載11個(gè)木薯花葉病毒株系共37個(gè)不同分離物的DNA-A序列，與DG1922和GZ1924的DNA-A序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，以番茄斑駁病毒序列（L14460）為樹(shù)根，應(yīng)用MEGA 7.0-ClastalW聚類(lèi)，構(gòu)建NJ（Neighbor-Joining）樹(shù)。結(jié)果如圖3所示，37個(gè)分離物均可嚴(yán)格地聚到各自所屬的不同株系分枝中，DG1922和GZ1924序列均與斯里蘭卡木薯花葉病毒株系聚在同一分枝，進(jìn)一步表明，引起國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒病的雙生病毒主要為斯里蘭卡木薯花葉病毒株系。

同樣，選擇3個(gè)地點(diǎn)共5個(gè)木薯普通花葉病毒陽(yáng)性檢測(cè)樣品分離物海南儋州（NX23，NX28）、廣東開(kāi)平（GD）和江西東鄉(xiāng)（JX1，JX3）目的條帶進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)顯示，目標(biāo)序列與已經(jīng)報(bào)道的拉丁美洲多個(gè)木薯普通花葉病毒分離物CsCMV-Arg104（KT002434）、CsCMV-Bra456（KT002429）和CsCMV-Arg128（KT002427）的依賴(lài)于RNA的RNA多聚酶基因（RdRp）序列同源性在91%～96%之間。引起木薯普通花葉病毒病的馬鈴薯X病毒組（Potexvirus）有5個(gè)株系，主要分布在阿根廷、巴西和哥倫比亞[15]，分別下載這些株系的24個(gè)拉丁美洲木薯普通花葉病毒分離物RdRp基因序列，以非洲花葉病毒株系為樹(shù)根，聚類(lèi)分析表明，國(guó)內(nèi)木薯普通花葉病毒株系與已經(jīng)報(bào)道的多個(gè)株系序列相似性較遠(yuǎn)，自為一個(gè)分枝，而且各個(gè)序列之間也有差異（圖4）。表明國(guó)內(nèi)的普通花葉病毒株系產(chǎn)生了較大的變異，形成獨(dú)立分枝，有進(jìn)化出新株系的可能性。

3? 討論

自從2016年在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)木薯花葉病毒?。ū狙芯渴覂?nèi)部資料）和2018年正式報(bào)道以來(lái)[4， 9]，陸續(xù)在國(guó)內(nèi)多個(gè)木薯種植地發(fā)現(xiàn)該病害。本研究通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)多地木薯花葉病毒病的田間調(diào)查、癥狀分析和病原鑒定，表明國(guó)內(nèi)已發(fā)生木薯花葉病毒病，但范圍還僅限于品種（種質(zhì)）保存基地，尚未傳播到生產(chǎn)一線(xiàn)。由雙生病毒引起的木薯花葉病的傳毒媒介為煙粉虱，主要引起木薯花葉病毒病短距離的傳播危害，遠(yuǎn)距離傳播主要通過(guò)罹病種莖和帶毒薯類(lèi)產(chǎn)品的調(diào)運(yùn)和農(nóng)產(chǎn)品交易等[1]，本研究團(tuán)隊(duì)于2016年首次發(fā)現(xiàn)木薯花葉病毒病為害的品種‘東莞紅尾，是種植了從引種隔離圃中調(diào)運(yùn)出來(lái)的種莖;2017年在海南文昌發(fā)現(xiàn)的2個(gè)出現(xiàn)癥狀的品種‘SC10和‘SC205，是由于前期種植了從東南亞引進(jìn)的感病種質(zhì)，導(dǎo)致部分植株被感染;而在本研究中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2018年和2019年各地出現(xiàn)癥狀的種質(zhì)，幾乎都來(lái)源于調(diào)運(yùn)的種莖，而當(dāng)?shù)氐闹髟云贩N，由于缺乏抗性，部分品種也出現(xiàn)了感病情況。這些數(shù)據(jù)表明，種植引進(jìn)和調(diào)運(yùn)的罹病種莖是2018年、2019年各?。▍^(qū)）出現(xiàn)病害的主要原因。2015年時(shí)濤等[16]通過(guò)有害生物風(fēng)險(xiǎn)性分析（PRA）程序評(píng)估木薯花葉病毒病在國(guó)內(nèi)的綜合風(fēng)險(xiǎn)值R為2.42，屬于高度危險(xiǎn)的病害，而且國(guó)內(nèi)的大部分主栽品種均不具備對(duì)該病的抗性[17-19]。綜上所述，加強(qiáng)病害監(jiān)測(cè)，禁止從疫區(qū)調(diào)運(yùn)種莖，是預(yù)防病害傳播、保障木薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要舉措。

本研究通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)多地木薯花葉病癥狀和病原的鑒定調(diào)查，發(fā)現(xiàn)目前引起國(guó)內(nèi)木薯產(chǎn)生花葉癥狀的有3種情況，即由SLCMV單獨(dú)感染引起的木薯斯里蘭卡花葉病毒病、SLCMV和CsCMV共同侵染引起的復(fù)合感染以及由CsCMV單獨(dú)侵染引起的木薯普通花葉病毒病。從采集樣品檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，海南、廣東、云南、廣西、貴州和福建6個(gè)?。▍^(qū)）都有斯里蘭卡木薯花葉病毒和普通花葉病毒的感染，而江西和湖南則以木薯普通花葉病毒感染為主。

研究人員根據(jù)雙生病毒結(jié)構(gòu)和序列的差異及其主要發(fā)生的地區(qū)，將木薯花葉病毒（CMV）分為11個(gè)株系和1個(gè)重組株系：即非洲木薯花葉病毒株系（African cassava mosaic virus， ACMV），木薯花葉病毒馬達(dá)加斯加株系（cassava mosaic Madagascar virus， CMMGV），東非木薯花葉病毒株系（East African cassava mosaic virus， EACMV），東非木薯花葉病毒烏干達(dá)變種（East African cassava mosaic-Ugandan variant， EACMV-

UG），東非木薯花葉病毒喀麥隆株系（East African cassava mosaic Cameroon virus， EACMCV），東非木薯花葉病毒肯尼亞株系（East African cassava mosaic Kenya virus， EACMKV），東非木薯花葉病毒馬拉維株系（East African cassava mosaic Malawi virus， EACMMV），東非木薯花葉病毒桑給巴爾株系（East African cassava mosaic Zanzibar virus， EACMZV），南非木薯花葉病毒株系（South African cassava mosaic virus， SACMV），非洲木薯花葉布基納法索病毒（African cassava mosaic Burkina Faso virus， ACMBFV），印度木薯花葉病毒株系（Indian cassava mosaic virus， ICMV）和斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）[20]。引起木薯普通花葉病的馬鈴薯X病毒組（Potexvirus）的5個(gè)株系則主要危害南美洲地區(qū)阿根廷、巴西和哥倫比亞的木薯。由于病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，而且需要適應(yīng)環(huán)境和品種的更替，常與寄主和其他病毒產(chǎn)生重組，從而變異成不同的株系。非洲強(qiáng)致病力的重組株系時(shí)有報(bào)道，目前在烏干達(dá)和加納地區(qū)的強(qiáng)致病力病毒株系EACMV-UG，為東非木薯花葉病毒株系和非洲花葉病毒株系的重組體[21]。木薯普通花葉病毒病主要發(fā)生在拉丁美洲地區(qū)，尚未在非洲和東南亞發(fā)現(xiàn)，盡管多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道南美洲的木薯普通花葉病毒對(duì)木薯的產(chǎn)量影響較小，但Venturini等[22]研究表明，巴西CsCMV的發(fā)生導(dǎo)致木薯品種‘BRS Kiriris和‘BRS Jari的產(chǎn)量損失達(dá)30%～60%。目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)雙生病毒和普通花葉病毒共同侵染木薯的報(bào)道，本研究檢測(cè)到國(guó)內(nèi)多地木薯同時(shí)攜帶2種病毒的情況屬首次報(bào)道。

國(guó)內(nèi)木薯花葉病毒病由斯里蘭卡木薯花葉病毒株系引起，與2015年來(lái)影響柬埔寨、越南和泰國(guó)木薯產(chǎn)業(yè)的病毒株系有非常高的序列相似性，表明目前國(guó)內(nèi)的木薯病毒與東南亞的株系有著很高的同源性，也可能直接或者間接來(lái)源于薯類(lèi)農(nóng)產(chǎn)品的邊境或者國(guó)際貿(mào)易。木薯普通花葉病毒引起的花葉癥狀不典型，不具備扭曲畸形的特征，田間觀察容易被忽視。聚類(lèi)分析顯示國(guó)內(nèi)的CsCMV與南美洲多個(gè)株系序列相似性在96%以下，推測(cè)木薯普通花葉病毒株系已長(zhǎng)期侵染國(guó)內(nèi)多個(gè)木薯品種，存在序列重組變異的可能，須通過(guò)全基因組序列測(cè)定及變異率分析進(jìn)行證明。國(guó)內(nèi)的木薯產(chǎn)業(yè)及其育種在“一帶一路”和國(guó)際合作的帶動(dòng)下，早期從哥倫比亞的國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）引進(jìn)了一些國(guó)外的優(yōu)良種質(zhì)[23]，也為病害的引入和傳播提供了可能，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)因該病害而導(dǎo)致木薯產(chǎn)量和品質(zhì)下降的報(bào)道，也是該病害沒(méi)有得到足夠重視的重要原因之一。

基于實(shí)際應(yīng)用的需要，木薯病毒的檢測(cè)技術(shù)在近年得到了快速發(fā)展。2019年Boykin等[24]通過(guò)結(jié)合PDQeX DNA純化技術(shù)與MinION和MinIT移動(dòng)測(cè)序設(shè)備，建立了便攜式的林間試驗(yàn)室（Tree Lab）系統(tǒng)，用于對(duì)非洲木薯花葉病毒的現(xiàn)場(chǎng)早期診斷，突破了傳統(tǒng)鑒定方法對(duì)大型設(shè)備的需求以及數(shù)據(jù)聯(lián)網(wǎng)分析等程序，為技術(shù)人員在田間對(duì)病害的準(zhǔn)確診斷提供了可能。Minato等[5]采用PCR技術(shù)對(duì)柬埔寨和越南的6480個(gè)木薯花葉病毒病疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明樣品感染率為7.6%，且發(fā)現(xiàn)14%的陽(yáng)性樣品無(wú)木薯花葉病毒病的典型癥狀。2015年Otti等[25]應(yīng)用高通量多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，可同時(shí)有效檢測(cè)非洲的2種木薯重要病毒，即花葉病毒（ACMV）和褐條病毒（UCBSV），也分同屬于DNA病毒和RNA病毒;Uke等[26]通過(guò)PCR和圖像識(shí)別技術(shù)檢測(cè)到引起印度木薯花葉的2種病毒印度木薯花葉病毒（ICMV）和斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV），但無(wú)法對(duì)2種病毒進(jìn)行有效區(qū)分。除了雙生病毒引起的花葉病，國(guó)際上還有木薯褐條病、蛙皮病和多種潛在病毒性病害，由于國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)該病的感染，其檢測(cè)的方向多為雙生病毒，除了存在普通花葉病毒的復(fù)合感染之外，是否還存在其他病毒的侵染，需要配合更多的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行深入分析。而作為分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)的基礎(chǔ)，高效率的核酸抽提，以及微量病毒的有效提純最為關(guān)鍵，很多假陰性的結(jié)果都與病毒核酸的抽提效率相關(guān)，同時(shí)作為最為便利的樣品來(lái)源，以葉片作為靶標(biāo)樣品是否最有效也需要作進(jìn)一步驗(yàn)證[27]。

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