董俊娜 謝柳青 楚文清 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 瞿倩

摘? 要：木本植物莖的發(fā)育在木材形成中具有重要意義。以菠蘿蜜葉綠素缺失突變體幼苗（Chlorophyll deficient mutant， CDM）為研究材料，選取正常幼苗作為對(duì)照（Control check， CK），觀察并測(cè)量其株高和基部莖粗。使用石蠟切片法和光學(xué)顯微技術(shù)對(duì)莖各節(jié)間進(jìn)行觀察，測(cè)量木質(zhì)部、韌皮部、表皮和周皮的厚度，比較CDM與CK之間的差異。結(jié)果顯示，CDM的株高和基部莖粗的增長(zhǎng)受到一定的抑制，各節(jié)間木質(zhì)部、韌皮部以及周皮的厚度均減小;相比次生木質(zhì)部，次生韌皮部的抑制作用更顯著。

關(guān)鍵詞：菠蘿蜜;葉綠素缺失突變體;莖;解剖結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.8????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Structural Analysis of the Stem of the Chlorophyll Deficient Mutant from Artocarpus heterophyllus Seedlings

DONG Junna1， XIE Liuqing2， CHU Wenqing1， YU Xudong1， CAI Zeping1*， LUO Jiajia2，3， QU Qian1

1. College of Forestry， Hainan University / Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract： The stem development of woody plants plays an important role in wood formation. In this study， the seedlings of the chlorophyll deficient mutants （CDM） of Artocarpus heterophyllus were selected as the research material and normal seedlings were selected as the control check （CK） to observe and measure plant height and basal stem diameter. The internodes of seedlings were observed by paraffin section and optical microscopy. The thickness of xylem， phloem， epidermis and periderm were measured， and the difference between CDM and CK was compared. The results showed that the increase of plant height， basal stem diameter of CDM were inhibited to some extent， and the thickness of xylem， phloem and periderm of each internode decreased. Compared with the secondary xylem， the inhibition of secondary phloem was more significant.

Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll deficient mutant; stem; anatomic structure

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.021

莖在植株中起到支撐和運(yùn)輸?shù)闹匾饔?，且在木材形成過(guò)程中具有重要意義[1]。木本植物莖的生長(zhǎng)包括初生生長(zhǎng)和次生生長(zhǎng)兩部分。初生生長(zhǎng)發(fā)生在莖的幼嫩組織中，莖頂端分生組織細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)共同決定了莖的伸長(zhǎng)，使植株長(zhǎng)高。在此過(guò)程中，產(chǎn)生初生木質(zhì)部和初生韌皮部，并分化出表皮。次生生長(zhǎng)在初生生長(zhǎng)完成之后發(fā)生，此時(shí)維管形成層分別向內(nèi)、向外產(chǎn)生次生木質(zhì)部和次生韌皮部，同時(shí)周皮取代表皮，于是莖不斷增粗[2-3]。

光合作用為綠色植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供必要的物質(zhì)和能量[4-5]。葉綠素是光合作用的重要色素，在光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換過(guò)程起著重要的作用[6-7]。葉綠素缺乏會(huì)導(dǎo)致植物對(duì)光能的利用率下降，從而影響其正常的能量供應(yīng)，在植物外觀形態(tài)上表現(xiàn)為葉片及莖出現(xiàn)黃化或白化現(xiàn)象[8]。白化現(xiàn)象在植物界中普遍存在，但是目前的研究大多在草本植物中開(kāi)展，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、小麥（Triticμm aestivμm）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）等[9-12]，對(duì)于木本植物的研究相對(duì)較少[13]。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus）是一種珍貴的木材樹(shù)種[14]。本課題組在野外考察中發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜葉綠素缺失突變體（chlorophyll deficient mutants， CDM），利用其母株成熟果實(shí)中的種子進(jìn)行栽種，分離得到子代CDM幼苗，作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行深入研究。付影等[15]對(duì)菠蘿蜜CDM形態(tài)和生理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明CDM的莖粗減小。鄭李婷等[16]和謝柳青等[17]分別對(duì)CDM嫩莖和次生生長(zhǎng)莖進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。然而莖中各節(jié)間的解剖結(jié)構(gòu)還未知。本研究通過(guò)石蠟切片法和光學(xué)顯微鏡技術(shù)，觀測(cè)并比較CDM莖中各節(jié)間的結(jié)構(gòu)變化，分析菠蘿蜜CDM莖的發(fā)育，為木本植物莖發(fā)育的研究提供新的思路。

1? 材料與方法

1.1? 材料

采用謝柳青等[17]的實(shí)驗(yàn)材料，母株為具有隱性葉綠素缺失遺傳基因的植株，從母株的成熟果實(shí)中剝離出種子，挑選飽滿的種粒種植于含有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，在光照和水分充足的條件下栽種，通過(guò)栽種分離出完全白化的CDM幼苗，選取正常幼苗作為對(duì)照（CK）。

1.2? 方法

1.2.1? 株高、基部莖粗測(cè)量? 待種子萌發(fā)后，分別對(duì)苗齡1、5、10、15、20、25、30、35、40 d的CDM及CK的株高和基部莖粗進(jìn)行觀察和測(cè)量，并拍照記錄。

1.2.2? 材料的固定與石蠟切片? 萌發(fā)至40 d時(shí)，植株株高和基部莖粗的增長(zhǎng)趨于平緩。此時(shí)參照J(rèn)agadish等[18]的方法，由上至下采取CDM及CK的每個(gè)節(jié)間，浸入FAA固定液[（50%酒精90 mL）+冰醋酸（5 mL）+甲醛（5 mL）]中固定24 h。在LEICA RM2245切片機(jī)上將固定好的材料進(jìn)行切片，切片厚度為10 μm，切片后采取番紅（2.5 g番紅+100 mL 70%酒精）和固綠（1 g固綠+100 mL 95%酒精）對(duì)染，封片后使用LEICA DFC295光學(xué)顯微鏡觀察和拍照。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

用刻度尺對(duì)植株的株高和基部莖粗進(jìn)行測(cè)量，采用Image J軟件對(duì)CDM及CK莖切片的橫切面、木質(zhì)部、韌皮部、表皮和周皮的厚度進(jìn)行測(cè)量，每項(xiàng)指標(biāo)均重復(fù)12組，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用u值檢驗(yàn)法對(duì)CDM與CK各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 株高和基部莖粗分析

CK在發(fā)育階段其莖為綠色，CDM則呈現(xiàn)出白色，同一苗齡，CDM相比CK，整體長(zhǎng)勢(shì)較弱（圖1A～圖1E）。二者的生長(zhǎng)發(fā)育均呈現(xiàn)出先快速生長(zhǎng)（1～15 d）、后緩慢生長(zhǎng)（16～40 d）的趨勢(shì)。在發(fā)育過(guò)程中，同一時(shí)期CDM的株高均小于CK，且二者之間的差異逐漸增大。發(fā)育至10 d時(shí)，CDM的株高為12.42 cm，是CK（16.22 cm）的76.57%，差異極顯著（圖1B、圖1F）;發(fā)育至40 d時(shí)，CDM的株高為20.06 cm，是CK（35.56 cm）的56.41%，差異極顯著（圖1E、圖1F）?？梢?jiàn)CDM株高的增長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制。同時(shí)CDM莖的加粗生長(zhǎng)也受到一定的影響。頂芽出土后1～15 d，CDM與CK的基部莖粗尚未出現(xiàn)顯著差異（圖1G）。發(fā)育至20 d時(shí)，CDM基部莖粗為3.56 mm，是CK（4.28 mm）的83.18%，二者開(kāi)始出現(xiàn)極顯著差異（圖1C、圖1G）。發(fā)育至40 d時(shí)，CDM的基部莖粗為3.81 mm，是CK（5.13 mm）的74.27%（圖1E、圖1G），差異極顯著，可見(jiàn)CDM基部莖粗的增長(zhǎng)受到明顯的抑制作用。

CDM莖節(jié)間1的直徑為1150.76 μm，是CK（2003.93 μm）的57.43%，二者差異極顯著（圖2A、圖2H、圖2W）。此后，在發(fā)育的同一時(shí)期，CDM莖節(jié)間的直徑均小于CK，且二者的增長(zhǎng)速度趨于一致，均呈現(xiàn)出先快速生長(zhǎng)（節(jié)間1～4）再緩慢生長(zhǎng)（節(jié)間5～10）的趨勢(shì)（圖2W）。CDM節(jié)間10的直徑為2711.92 μm，是CK（4360.24 μm）的62.20%，差異極顯著（圖2Q、圖2U、圖2W）。二者在相同環(huán)境中生長(zhǎng)同樣的時(shí)間，CDM只發(fā)育了10個(gè)節(jié)間，比CK（12個(gè)）少2個(gè)，CK直徑在11～12節(jié)間迅速生長(zhǎng)，CDM則死亡（圖2R、圖2V、圖2W）?？梢?jiàn)CDM莖的加粗生長(zhǎng)受到了抑制。

2.2? 木質(zhì)部結(jié)構(gòu)分析

CDM初生木質(zhì)部在1～10節(jié)間生長(zhǎng)較為平緩;CK初生木質(zhì)部則在節(jié)間4出現(xiàn)一個(gè)生長(zhǎng)高峰（圖3W）。節(jié)間1，CDM初生木質(zhì)部的厚度為32.03 μm，是CK（46.93 μm）的68.25%，差異極顯著（圖3A、圖3H、圖3W）。可見(jiàn)CDM莖初生木質(zhì)部的生長(zhǎng)受到影響。同時(shí)CDM莖次生木質(zhì)部的生長(zhǎng)也受到了抑制。CK在節(jié)間3開(kāi)始出現(xiàn)次生木質(zhì)部，CDM則在節(jié)間4出現(xiàn)，與CK相比較晚（圖3C、圖3K、圖3W）。節(jié)間4，CDM的次生木質(zhì)部的厚度為74.16 μm，是CK（278.21 μm）的26.66%，差異極顯著（圖3D、圖3K、圖3W）。CDM及CK次生木質(zhì)部的生長(zhǎng)發(fā)育均呈現(xiàn)先快速生長(zhǎng)（節(jié)間4～6）后緩慢生長(zhǎng)（CDM：節(jié)間7～10、CK：節(jié)間7～12）的趨勢(shì)。發(fā)育至節(jié)間10時(shí)，CDM次生木質(zhì)部的厚度為313.58 μm，是CK（801.62 μm）的39.12%，差異達(dá)極顯著（圖3Q、圖3U、圖3W）。在發(fā)育過(guò)程中，同一時(shí)期CDM初生木質(zhì)部及次生木質(zhì)部的厚度均小于CK，尤其在次生木質(zhì)部生長(zhǎng)過(guò)程中，二者之間的差異逐漸增大（圖3W），可見(jiàn)CDM莖木質(zhì)部的發(fā)育受到嚴(yán)重抑制。

2.3? 韌皮部結(jié)構(gòu)分析

發(fā)育至40 d時(shí)，CDM節(jié)間1初生韌皮部的厚度為38.61 μm，是CK（43.29 μm）的89.19%，二者差異達(dá)顯著（圖4A、圖4H、圖4W）;節(jié)間3，CDM初生韌皮部的厚度為37.27 μm，是CK（47.95 μm）的77.73%，二者差異極顯著（圖4C、圖4J、圖4W）。每一個(gè)對(duì)應(yīng)的節(jié)間，CDM初生韌皮部的厚度均小于CK（圖4W）。節(jié)間10，CDM初生韌皮部的厚度為33.47 μm，是CK（51.33 μm）的65.21%，差異極顯著（圖4Q、圖4U、圖4W）?？梢?jiàn)CDM莖初生韌皮部的發(fā)育受到抑制。CK在節(jié)間3出現(xiàn)次生韌皮部，CDM則在節(jié)間6出現(xiàn)，晚于CK（圖4C、圖4M、圖4W）。節(jié)間6，CDM次生韌皮部的厚度為36.32 μm，是CK（70.08 μm）的51.83%，二者差異極顯著（圖4F、圖4M、圖4W）。CDM次生韌皮部厚度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，CK則一直增加，且每一對(duì)應(yīng)節(jié)間，CDM次生韌皮部的厚度均小于CK（圖4W）。節(jié)間10，CDM次生韌皮部的厚度為38.79 μm，是CK（98.03 μm）的39.57%，差異極顯著（圖4Q、圖4U、圖4W）;可見(jiàn)CDM莖次生韌皮部的發(fā)育同樣受到了抑制。

2.4? 表皮和周皮結(jié)構(gòu)分析

發(fā)育至40 d時(shí)，CDM節(jié)間1的表皮厚度為12.23 μm，是CK（9.47 μm）的129.14%，二者差異極顯著（圖5A、圖5H、圖5W）;節(jié)間1～7，每一個(gè)對(duì)應(yīng)的節(jié)間，CDM表皮的厚度均大于CK（圖5W）。節(jié)間10，CDM的表皮厚度為7.12 μm，是CK（6.06 μm）的117.49%，二者差異極顯著。CDM在節(jié)間8出現(xiàn)周皮，晚于CK節(jié)間5（圖5S、圖5E、圖5W）。出現(xiàn)周皮后，二者的表皮均退化，厚度逐漸減小（圖5W）。CDM與CK的周皮長(zhǎng)勢(shì)相同，呈逐漸增加的趨勢(shì)（圖5W）。節(jié)間8，CDM周皮厚度為31.58 μm，是CK（32.23 μm）的97.98%，二者無(wú)顯著性差異（圖5O、圖5S、圖5W）。節(jié)間10，CDM周皮的厚度為35.80 μm，是CK（38.93 μm）的91.96%，差異顯著（圖5Q、圖5U、圖5W）。可見(jiàn)CDM莖周皮出現(xiàn)的時(shí)間被延遲。

2.5? 莖中次生結(jié)構(gòu)起始節(jié)間比較

由表1可知，CK幼苗莖中有25%的次生木質(zhì)部在第2個(gè)節(jié)間出現(xiàn)，75%在第3節(jié)間出現(xiàn);次生韌皮部有75%在第3節(jié)間出現(xiàn)，25%在第4節(jié)間出現(xiàn)。CDM幼苗莖中約33%的次生木質(zhì)部在第3節(jié)間出現(xiàn)，約67%在第4節(jié)間出現(xiàn)，次生韌皮部約33%在第4節(jié)間出現(xiàn)，67%在第6節(jié)間出現(xiàn)。計(jì)算可知，CDM與CK莖中出現(xiàn)次生韌皮部的節(jié)間之差大于次生木質(zhì)部，說(shuō)明相對(duì)于次生木質(zhì)部，CDM次生韌皮部的起始受到的抑制作用更大。

CK幼苗莖中有75%的周皮在第5節(jié)間出現(xiàn)，25%在第6節(jié)間出現(xiàn)。CDM幼苗莖中各有約33%的周皮分別在第6節(jié)間、第8節(jié)間和第9節(jié)間出現(xiàn)。CDM與CK莖中出現(xiàn)周皮的節(jié)間之差大于次生韌皮部。

3? 討論

莖的加粗生長(zhǎng)包括木質(zhì)部和韌皮部的加粗生長(zhǎng)，二者的次生生長(zhǎng)在整個(gè)加粗生長(zhǎng)的過(guò)程中起著重要作用。本研究中CDM的莖比CK細(xì)弱，其主要原因是CDM莖中次生木質(zhì)部和次生韌皮部的發(fā)育受到了抑制。謝柳青等[17]發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)40 d的CDM次生生長(zhǎng)莖中下調(diào)的基因在氨基酸的生物合成、碳代謝、氧化磷酸化等途徑中顯著富集;同時(shí)其上調(diào)基因主要富集在半乳糖代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等過(guò)程，表明此時(shí)CDM次生生長(zhǎng)莖中基礎(chǔ)代謝受到影響。此外，CDM莖中初生木質(zhì)部、初生韌皮部的發(fā)育也受抑制。有研究表明，蔗糖可以刺激韌皮部細(xì)胞的分裂和分化[19]。在鄭李婷等[16]對(duì)菠蘿蜜嫩莖的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，CDM嫩莖中糖代謝途徑的基因下調(diào)表達(dá)。可見(jiàn)，能量供應(yīng)出現(xiàn)異常可能是導(dǎo)致莖初生生長(zhǎng)和次生生長(zhǎng)受到抑制的原因之一。

相比于次生木質(zhì)部，CDM莖中次生韌皮部受到的抑制作用更為明顯。莖中次生木質(zhì)部將水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)從下向上運(yùn)輸?shù)街参矬w的形態(tài)學(xué)上端，次生韌皮部則將葉片中的光合產(chǎn)物從上至下運(yùn)輸?shù)礁縖20]。光合作用的核心色素葉綠素在植物的綠色組織中均有分布，其中在葉中的含量最多[21]。因此和根部相比，葉綠素缺失導(dǎo)致光合產(chǎn)物的減少對(duì)CDM葉片中有機(jī)物合成的影響更大。葉片中有機(jī)物含量減少，對(duì)于韌皮部的卸載功能要求降低。因此，CDM莖中次生韌皮部形成受到的抑制作用更大可能是對(duì)上述過(guò)程的一種響應(yīng)，但其分子機(jī)理目前尚不明確。

本研究從結(jié)構(gòu)方面報(bào)道了菠蘿蜜CDM與CK在株高、基部莖粗、木質(zhì)部、韌皮部、表皮和周皮上的差異，然而影響CDM莖發(fā)育的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，本研究為木本植物莖發(fā)育的研究提供新的思路。

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