余成華 朱春艷 段紹鳳 楊秋雄 韓俊 梁艷麗

摘? 要：通過對(duì)滇龍膽的開花物候與交配系統(tǒng)進(jìn)行觀測(cè)，統(tǒng)計(jì)不同處理的結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率，分析滇龍膽開花物候與交配系統(tǒng)等繁育特征。結(jié)果表明：滇龍膽花期在10月中旬至12月中旬，單花花期持續(xù)17～19 d，單個(gè)花序花期可持續(xù)33～37 d，單株水平花期可持續(xù)8周，群體水平開花期持續(xù)時(shí)間為60 d以上，具有雌雄異位和雌雄異熟特征。滇龍膽雜交指數(shù)（OCI）值為5，花粉-胚珠比（P/O）值集中于（582.8±441.2）～（140 5.8±550.8）之間，結(jié)合人工授粉套袋試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)滇龍膽的繁育系統(tǒng)類型為兼性異交型，部分自交親和，需要傳粉者，不存在無融合生殖。自然狀態(tài)下結(jié)實(shí)率較高，通過人工補(bǔ)充授粉，可顯著提高滇龍膽結(jié)實(shí)率。

關(guān)鍵詞：滇龍膽;雜交指數(shù);交配系統(tǒng);花粉胚珠比;開花物候

中圖分類號(hào)：S184????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Flowering Phenology and Mating System of Gentiana rigescens

YU Chenghua1，2，3， ZHU Chunyan1，2，3， DUAN Shaofeng1，2，3， YANG Qiuxiong1，2，3， HAN Jun2，3，

LIANG Yanli1，2，3

1. Yunnan Agricultural University， National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasms Utilization & Innovation of Chinese Medicinal Materials in Southwest / Kunming， Yunnan 650201， China; 2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Medici Plant Biology， Kunming， Yunnan 650201， China; 3. College of Agriculture and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： Through the observation of the flowering phenology and mating system of Gentiana rigescens， the seed setting rate and seed setting rate of different treatments were counted. The influence of flowering phenology and mating system on breeding was analyzed. The results showed that the florescence was from mid- October to the end of November， the florescence of inflorescence lasted for 33～37 days， the florescence of single flower lasted for 17～19 days， the florescence of single plant lasted for 8 weeks， and the florescence of population lasted for more than 60 days. The pollen was most active within 2～3 days of opening， and the stigma was inactive. The stamens developed completely and the pistils continued to grow after opening. The outcrossing index （OCI） was 5， which belonging to the heterozygous type. Some of them were self-compatible and pollination needed. The pollen ovule ratio （P/O） was between 582.8441.2 and 1405.8550.8. The breeding system belonged to the facultative heterozygous type. The seed setting rate was higher in the natural state， and there was asexual propagation. The seed setting rate could be significantly increased by artificial pollination.

Keywords： Gentiana rigescens; hybridization index; mating system; pollen-ovule ratio; flowering phenology

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.019

高山地區(qū)是植物生長(zhǎng)的極端環(huán)境之一，高山植物繁殖過程面臨許多挑戰(zhàn)，低溫、傳粉限制、水和光照等都會(huì)影響其繁殖[1]，相對(duì)于其他植物，高山植物需要面對(duì)更加惡劣的氣候環(huán)境，植物需要更加頑強(qiáng)的適應(yīng)機(jī)制來適應(yīng)高山環(huán)境才能成功生存和繁殖。因此，高山植物的繁殖策略受到廣泛關(guān)注。有性生殖是有花植物繁衍的最重要方式。而開花時(shí)間即開花物候，因?qū)χ参锸诜鄢潭取鞣壅叩脑L花行為以及雌雄適合度等的影響，對(duì)植物繁殖交配的成功產(chǎn)生重要影響[2]。開花物候與環(huán)境條件之間的相互作用直接影響著植物交配系統(tǒng)[3]，如開花太早或太晚均會(huì)因?yàn)槿鄙儆行У膫鞣壅叨荒苡行ЫY(jié)實(shí)。

滇龍膽（Gentiana rigescens）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，為云南省道地藥材，分布于海拔1100～3000 m，是典型的高山植物。滇龍膽的盛花期在11月，恰在寒冷的冬季[4-5]，卻能夠適應(yīng)環(huán)境成功繁殖。因此，對(duì)滇龍膽繁育特征的研究，有利于解析高山植物繁殖適應(yīng)機(jī)制。同時(shí)，對(duì)滇龍膽開花物候特點(diǎn)和繁殖特征的研究，也為滇龍膽品種選育、高效栽培措施的制定提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于云南省臨滄市云縣漫灣鎮(zhèn)，屬云南省西南部，地理位置9943～10033 E，2356～2446 N，海拔2200 m，屬北亞熱帶氣候類型，年降雨量1367.2 mm，主要集中在7—9月;土壤以沙壤土為主。野外實(shí)驗(yàn)于2018、2019年的10—12月進(jìn)行。

1.2? 方法

1.2.1? 單花水平觀測(cè)? 隨機(jī)選取30株開單花的植株，在花朵未開放前，用記號(hào)筆和小標(biāo)牌掛牌標(biāo)記，花朵開放后，觀測(cè)單花形態(tài)變化并進(jìn)行拍照記錄。每天早上、中午和傍晚各觀察一次，記錄數(shù)據(jù)。觀測(cè)單花開放狀態(tài)：花冠開裂時(shí)間、萎蔫時(shí)間、凋落時(shí)間、開花持續(xù)時(shí)間、開花高峰、單花花期、花藥變化、柱頭變化等。

1.2.2? 花序水平觀測(cè)? 隨機(jī)選擇即將開放的花序30朵，掛牌做標(biāo)記，每天上午7：00進(jìn)行觀察記錄，并照相。觀察記錄描述花序的開放狀態(tài)：始花時(shí)間、末花時(shí)間、花序1/2開時(shí)間、花序開放持續(xù)時(shí)間、小花開放順序、當(dāng)天開放小花數(shù)、花序開放狀態(tài)、顏色變化、花序開放持續(xù)時(shí)間。

1.2.3? 單株水平觀測(cè)? 隨機(jī)選取滇龍膽30株，掛牌做標(biāo)記，從第一朵單花開始開花（判斷花開放的標(biāo)準(zhǔn)是花瓣剛展開揚(yáng)起）開始記錄，每天12：00觀察記錄一次，直至最后一朵單花敗落。每天記錄單花變化情況，始花期、開花高峰期、終花期、花序開放數(shù)、單株開花持續(xù)時(shí)間等。

1.2.4? 群體水平觀測(cè)? 采取直接觀測(cè)與詢問種植管理者相結(jié)合，記錄萌芽期、現(xiàn)蕾期、始花期、盛花期、花瓣凋謝期（判斷花朵枯萎的標(biāo)準(zhǔn)是花被變色、失去光澤、質(zhì)地變軟）、開花高峰期、開花持續(xù)時(shí)間。

1.2.5? 花部形態(tài)特征觀測(cè)? 隨機(jī)選取完全開放單花30朵，用電子游標(biāo)卡尺和直尺測(cè)量與其開花生物學(xué)相關(guān)的形態(tài)特征值，如花冠、花瓣、花萼、雌雄蕊各部分的長(zhǎng)度、顏色、形狀等，并拍照記錄。

1.2.6? 花粉胚珠比（P/O）及雜交指數(shù)（OCI）? 花粉胚珠比（P/O）為平均單花花粉總量除以單花胚珠數(shù)。花粉計(jì)數(shù)方法為：隨機(jī)選取盛花期滇龍膽單花30朵，以單花為單位，將單花中的花藥全部取出，定容至1 mL，取5 μL統(tǒng)計(jì)所有花粉數(shù)，最后換算成單花花粉量。胚珠計(jì)數(shù)方法為：隨機(jī)選取30朵單花，將單花中的胚珠全部取出，定容至250 μL，取5 μL統(tǒng)計(jì)所有胚珠數(shù)，最后換算成單花胚珠數(shù)量，然后根據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判交配系統(tǒng)類型;雜交指數(shù)（OCI）由3個(gè)花部特征（花序直徑、花朵大小及開花行為）決定，根據(jù)Dafni的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算和評(píng)判[6]。

1.2.7? 人工交配處理? 在滇龍膽盛花期，隨機(jī)選擇長(zhǎng)勢(shì)良好一致健康植株，每個(gè)處理至少30朵，重復(fù)3次。進(jìn)行以下處理。（1）對(duì)照（CK）：不進(jìn)行處理，自然授粉;（2）處理1（不去雄套紙袋）：用以檢測(cè)自發(fā)自交發(fā)生的機(jī)率;（3）處理2（去雄套紙袋，不進(jìn)行授粉）：用以檢測(cè)是否存在無融合生殖現(xiàn)象;（4）處理3（去雄套網(wǎng)袋）：用以檢測(cè)是否存在風(fēng)媒傳粉現(xiàn)象;（5）處理4（去雄不套袋）：用以檢測(cè)傳粉昆蟲對(duì)生殖的貢獻(xiàn);（6）處理5（同株同花授粉）：檢測(cè)自交親和性;（7）處理6（同株異花授粉）：保留即將開放小花去雄套袋，等柱頭可授性最高時(shí)，再授以同株異花的花粉，套袋;（8）處理7（異株異花授粉），檢測(cè)異交親和性。所有的去雄工作均在花藥未散粉時(shí)進(jìn)行，人工授粉時(shí)先采集散粉的花粉，用毛筆蘸取花粉后或用鑷子直接涂抹至柱頭上。試驗(yàn)期間，對(duì)套袋的花朵經(jīng)常進(jìn)行檢查，揭袋換氣，防止霉變。授粉2個(gè)月后檢測(cè)各處理結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率，翌年1月采集果實(shí)，統(tǒng)計(jì)種子數(shù)，計(jì)算平均每果實(shí)種子數(shù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)Duncans檢驗(yàn)、差異顯著性分析，Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單花開放動(dòng)態(tài)觀測(cè)

如圖1所示，單花花期經(jīng)歷了萌芽到出現(xiàn)花蕾，到花冠完全開放，花藥完全開裂散粉，花藥脫落，花絲萎蔫，柱頭伸出花冠，花冠萎蔫，子房膨大等一系列過程，單花開花物候期持續(xù)17～19 d。單花萌芽期持續(xù)4～6 d（圖1A），花冠緊縮閉合，且在這個(gè)時(shí)期雄蕊發(fā)育高于雌蕊;現(xiàn)蕾期持續(xù)6 d（圖1C～圖1D），花苞逐漸伸長(zhǎng)至出現(xiàn)紫紅色，雌蕊和雄蕊也逐漸伸長(zhǎng);始花期持續(xù)2 d（圖1E），花冠微微開裂至1/2花冠;盛花期持續(xù)3 d（圖1F、圖1G），雄蕊的花粉囊逐漸開裂至花粉完全散出，雌蕊逐漸伸長(zhǎng)至高于雄蕊，柱頭開始開裂伸長(zhǎng)至高于花冠;花瓣凋零期持續(xù)2 d（圖1H），花冠開始閉合到完全閉合，直至萎蔫，但不脫落。雄蕊脫落，子房膨大。上述結(jié)果表明，滇龍膽的單花從花芽到花朵開放需要經(jīng)歷14 d的發(fā)育，花朵開放后經(jīng)歷5～6 d的盛開期完成傳粉受精，之后花冠枯萎，包裹在發(fā)育的子房表面。子房進(jìn)一步完成下一階段種子的發(fā)育。

2.2? 花序開放動(dòng)態(tài)觀測(cè)

滇龍膽花屬于聚傘花序，如圖2所示，一般由1～4個(gè)花序組成，每個(gè)植株花序有小花5～25朵或是更多，花序花期可持續(xù)33～37 d。花序從10月底進(jìn)入花蕾期，花蕾期可持續(xù)10～14 d，到11月中旬進(jìn)入盛花期。由花序每天開放的小花數(shù)可知，以花序?yàn)閱挝坏拈_放持續(xù)時(shí)間為16～ 18 d，其中在花序開始開花第11～19 d是花序開花的高峰期，其開花的花數(shù)量最多，之后開放花數(shù)逐漸減少（圖3）?；ㄐ蛩缴?，花朵的開放一般從頂端開始，然后依次向下;先開放的單花也最先凋落。

2.3? 單株開放動(dòng)態(tài)觀測(cè)

通過對(duì)滇龍膽單株花序持續(xù)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，滇龍膽的單株有1至多個(gè)花序，小花多數(shù)，單株水平花期可持續(xù)8周（圖4）。從11月進(jìn)入開花期，至12月末全株小花凋謝。在整個(gè)開花期間，側(cè)枝花蕾不斷長(zhǎng)出，花序不斷開放。單株開花高峰期為開花第4～6周，每天開放花序數(shù)為1～2朵，之后開放花序逐漸減少，直至單株花序上花朵完全開放。

2.4? 花部形態(tài)特征觀測(cè)結(jié)果

滇龍膽花呈錐狀桶形或?qū)捦靶危▓D5），花朵由花冠、萼片、雄蕊和雌蕊組成;花朵開放時(shí)花冠頂端分裂張開，呈五角星形，花冠長(zhǎng)度在2～ 2.5 cm之間，花冠顏色呈紅紫色或藍(lán)紫色。通過對(duì)滇龍膽花朵整個(gè)發(fā)育階段的觀測(cè)，測(cè)量了各個(gè)階段花朵的雄蕊長(zhǎng)、雌蕊長(zhǎng)、花苞長(zhǎng)、小總花苞長(zhǎng)和萼片長(zhǎng);從雄蕊和雌蕊的測(cè)量結(jié)果（圖6、圖7）來看，研究發(fā)現(xiàn)花朵的發(fā)育有雌雄異位現(xiàn)象，在現(xiàn)蕾期以前，雄蕊長(zhǎng)度都顯著長(zhǎng)于雌蕊;特別是在萌芽初期雄蕊長(zhǎng)度（1.0±0.1）cm，雌蕊長(zhǎng)度（0.5±0.1）cm，雄蕊的長(zhǎng)度是雌蕊的2倍。之后的現(xiàn)蕾期雄蕊長(zhǎng)度發(fā)育減緩，雌蕊迅速發(fā)育，直到始花期（圖6E），雄蕊和雌蕊發(fā)育長(zhǎng)度趨于一致，長(zhǎng)度在（1.65±0.1）cm，此時(shí)雄蕊發(fā)育完全，花藥發(fā)育飽滿;在盛花期（圖6F、圖6G）雌蕊會(huì)進(jìn)一步發(fā)育生長(zhǎng)，最終長(zhǎng)于雄蕊，此時(shí)柱頭具有可授性，可以完成傳粉受精過程。在之后的發(fā)育中，柱頭完成受精，雌蕊下部子房發(fā)育膨大;雄蕊花藥和花絲枯萎最終脫落。花苞的發(fā)育在完成受精前都是一個(gè)逐漸生長(zhǎng)的過程（圖7），在發(fā)育到15 d時(shí)生長(zhǎng)減緩長(zhǎng)度在（3.6±0.1）cm。小總花苞長(zhǎng)和萼片長(zhǎng)度發(fā)育均緩慢生長(zhǎng)，在發(fā)育到15 d時(shí)長(zhǎng)度分別為（1.2±0.1）cm和（0.9±0.1）cm。

2.5? OCI值

由表1可看出花朵直徑集中在（15±1）mm～ （16.67±1.15）mm之間（>6 mm，記為3）;對(duì)花藥開裂與柱頭可授性時(shí)間間隔的觀測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花藥先開裂，柱頭后生長(zhǎng)伸出花冠（圖6E）;研究發(fā)現(xiàn)開花第2天花粉活力最高，開花3～4 d后柱頭才具有可授性，所以滇龍膽花朵的發(fā)育屬于雄先熟（1）類型;在進(jìn)一步的觀測(cè)中，研究發(fā)現(xiàn)單花開放當(dāng)天，隨著柱頭伸出花冠，花藥遠(yuǎn)離柱頭，之后花藥開裂散粉脫落，與柱頭沒有接觸，柱頭與花藥在空間上是分離的，雌蕊和雄蕊的空間間隔在（2.33±0.29）mm～（3.33±1.15）mm之間，即定義雌雄蕊器官在空間上存在分離，記為1。雜交指數(shù)（OCI）值為5，根據(jù)Dafni標(biāo)準(zhǔn)，滇龍膽屬于異交型，部分自交親和，需要傳粉者。

2.6? P/O值

滇龍膽的P/O測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，單花花粉量平均于（976675623）～（12940018543）之間，單花胚珠數(shù)為（9620）～（16079），則P/O值集中于（582.8441.2）～（1405.8550.8）之間。根據(jù)Cruden[7]的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，滇龍膽的繁育系統(tǒng)類型屬于兼性異交型。

2.7? 交配系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果

通過人工授粉套袋等處理對(duì)滇龍膽交配系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證（圖8）。結(jié)果表明，在自然條件下，滇龍膽的結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率分別為90%和75.27%，說明滇龍膽交配系統(tǒng)對(duì)高山環(huán)境適應(yīng)較好;去雄套紙袋結(jié)實(shí)率10%、結(jié)籽率1.77%，顯著低于自然對(duì)照，說明滇龍膽不存在無融合生殖現(xiàn)象。而同株異花授粉滇龍膽結(jié)籽率高達(dá)82.71%，顯著高于自然對(duì)照，說明滇龍膽具有高度的自交親和特性。不去雄套紙袋隔離昆蟲傳粉的處理，其結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率顯著降低，分別為43.00%和17.88%，說明滇龍膽雖然自交親和，自發(fā)自交現(xiàn)象出現(xiàn)頻率極低，需要傳粉者為其傳粉才能結(jié)實(shí)。去雄套網(wǎng)袋的結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率分別為12.44%和1.77%，而去雄不套袋具有較高的結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率，分別為83.33%和86.47%，說明為滇龍膽花朵傳粉方式可能是蟲媒傳粉，風(fēng)媒傳粉率低。滇龍膽自然條件下的結(jié)籽率為75.27%，而通過同株異花授粉和異株異花授粉后，結(jié)籽率顯著提高至81.24%和93.67%，說明人工補(bǔ)充授粉，可顯著提高其結(jié)籽率，說明自然條件下滇龍膽存在花粉限制。

3? 討論

開花過程是植物生長(zhǎng)和繁殖的關(guān)鍵階段[8-9]。滇龍膽花屬于聚散花序，其頂端先開放，依次向下進(jìn)行，從而延長(zhǎng)了花期，增加授粉時(shí)間，從而提高授粉幾率[10]。滇龍膽花期主要集中在10月中旬至12中旬;整個(gè)花序花期可長(zhǎng)達(dá)30 d以上，單花花期在19～21 d，單花從萌芽到花朵盛開需要15 d。植物對(duì)其傳粉者的吸引主要集中在花部特征上[11-12]，滇龍膽花朵呈錐狀桶形或?qū)捦靶?，昆蟲進(jìn)入花內(nèi)基部舔舐花蜜時(shí)可將身上大量花粉散播到柱頭上，完成授粉;開放后花萼呈五角星形，且顏色呈紫紅色和藍(lán)紫色有利于吸引傳粉昆蟲。

研究發(fā)現(xiàn)，滇龍膽雌蕊和雄蕊存在雌雄異位的現(xiàn)象，并且雄蕊比雌蕊先熟，表現(xiàn)出雌雄異熟。滇龍膽花開放后雄蕊不再生長(zhǎng)，而雌蕊繼續(xù)生長(zhǎng)，柱頭從花藥上方伸出，隨后頂端分成2裂，柱頭的2裂彎曲，改變了花中雌蕊的位置以及柱頭和花藥之間的相對(duì)距離[13]。滇龍膽花雌雄的成熟在時(shí)間上的分離以及雌蕊和雄蕊在空間上的異位，降低了自花授粉的可能性，促進(jìn)異株異花授粉，從而增強(qiáng)其后代的環(huán)境適應(yīng)能力[14-16]。完成受精后花萼逐漸閉合，雌蕊下部的子房膨大發(fā)育。通過對(duì)授粉后滇龍膽花朵的持續(xù)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)滇龍膽花冠枯萎后并不會(huì)脫落，而是緊緊閉合包裹著內(nèi)部已經(jīng)完成授粉的雌蕊，包裹的花被可以保護(hù)子房不受低溫的侵害，這種進(jìn)化的特征或許就是滇龍膽能夠成功適應(yīng)高山環(huán)境的關(guān)鍵原因。

通過雜交指數(shù)和花粉胚珠比的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)滇龍膽花屬于兼性異交型;人工輔助授粉試驗(yàn)結(jié)果顯示滇龍膽繁育方式以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者，不存在無融合生殖。自然狀態(tài)下滇龍膽的結(jié)籽率可達(dá)75.27%，說明其異交傳粉機(jī)制有效。而在不去雄套袋的自花授粉情況下結(jié)籽率為16.29%，說明在極端缺少傳粉者情況下，物種會(huì)保持一定的自花傳粉來維持物種的生存與繁衍[17]。滇龍膽柱頭在開花后會(huì)分裂成2裂并向外彎曲，增大觸及花粉的可能性，無處理套袋結(jié)實(shí)率為41.67%也證實(shí)了這一點(diǎn)。

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