尚宇瀚，洪歡歡，郭項(xiàng)雨，白 樺，聞路紅，馬 強(qiáng)

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.寧波大學(xué)高等技術(shù)研究院，浙江 寧波 315211)

芬太尼是一類作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中μ-阿片受體的脂溶性合成精神活性物質(zhì)，在醫(yī)學(xué)上常用于鎮(zhèn)痛和麻醉。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，芬太尼的鎮(zhèn)痛效果是嗎啡的80～100倍[1-2]，由于其具有強(qiáng)大的類阿片特性，常被濫用于醫(yī)療以外的場(chǎng)景。據(jù)美國(guó)緝毒局介紹，芬太尼通常被添加到海洛因中以增加其效力，或被偽裝成高效力海洛因。許多吸食者在不知情下過量吸食芬太尼，最終導(dǎo)致死亡[3]。近年來，芬太尼的消耗量不斷攀升，濫用致死事件也越來越多，已引發(fā)全球關(guān)注[4-6]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局、加拿大衛(wèi)生部等監(jiān)管機(jī)構(gòu)多次發(fā)布芬太尼安全性公告及警示信息[7]，我國(guó)公安部、國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局、國(guó)家禁毒辦公室聯(lián)合發(fā)布了《非藥用類麻醉藥品和精神藥品列管辦法》，將芬太尼類化合物整類列入管制[8]。

芬太尼的分子結(jié)構(gòu)來源于嗎啡，其合成方法由Janssen首次報(bào)道[9]。在過去的幾十年中，以此為基礎(chǔ)，大量合成了多種新型芬太尼類化合物，其藥效與芬太尼相似甚至更強(qiáng)。雖然這些新型芬太尼類化合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不盡相同，但都具有相似的骨架結(jié)構(gòu)，示于圖1。目前，設(shè)計(jì)新型芬太尼類化合物主要有以下幾種方式：1) 在R1選擇位阻較小的取代基或H原子；2) 在R2引入推電子基團(tuán)；3) 在R3和R4的一處或多處引入吸電子基團(tuán)；4) 在R5引入位阻較大的取代基[10]。芬太尼類化合物的合成工藝簡(jiǎn)單、原料易得，對(duì)人員和設(shè)備要求較低，導(dǎo)致其更新?lián)Q代迅速。這對(duì)執(zhí)法部門的監(jiān)管水平和檢測(cè)技術(shù)提出了更高要求。

圖1 芬太尼類化合物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of fentanyl analogues

芬太尼類化合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[11-14]。雖然色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在檢測(cè)通量、靈敏度和準(zhǔn)確性上具有較大優(yōu)勢(shì)，但對(duì)儀器工作環(huán)境要求較高，樣品前處理過程復(fù)雜而耗時(shí)，不能滿足一線執(zhí)法人員現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。原位電離質(zhì)譜(ambient ionization mass spectrometry, AIMS)[15]具有無需或者僅需簡(jiǎn)單的樣品前處理、分析速度快、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，已被應(yīng)用于芬太尼類化合物檢測(cè)中，并取得了理想的效果。例如，Poklis等[16]采用實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time, DART)技術(shù)檢測(cè)200種藥品配方中17種常見藥物，對(duì)芬太尼的檢出限可達(dá)0.01 mg/L。Sisco等[17-19]將實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜法應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢測(cè)中，建立了芬太尼類化合物的現(xiàn)場(chǎng)快檢方法，并評(píng)估了法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中芬太尼類化合物的殘留情況。

介質(zhì)阻擋放電電離(dielectric barrier discharge ionization, DBDI)[20]是一種新型常壓敞開式電離源[21]，其原理是通過使用直流電電離載氣產(chǎn)生的等離子體探針電離樣品。介質(zhì)阻擋放電電離源的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、工作穩(wěn)定，所需電壓和能量均低于常用的原位電離方法，已被應(yīng)用于食品安全、公共安全、生命科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。本研究擬采用介質(zhì)阻擋放電電離質(zhì)譜法檢測(cè)46種芬太尼類化合物，并基于二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)歸納特征性碎裂規(guī)律，希望為執(zhí)法人員進(jìn)行已知芬太尼類化合物的快速檢測(cè)和潛在未知芬太尼類化合物的非靶向篩查提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

AmaZon Speed型離子阱質(zhì)譜儀：德國(guó)Bruker Daltonics公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離源、注射泵、Trap Control 7.0儀器控制軟件以及Data Analysis 4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；DBDI-100型介質(zhì)阻擋放電電離源：寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司產(chǎn)品，配有毛細(xì)管托架與固體樣品平臺(tái)；Milli-Q Integral 5超純水機(jī)：德國(guó)Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

46種芬太尼類化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度均大于99%)：上海原思標(biāo)物科技有限公司產(chǎn)品；空白藥片樣品(Melatonin Plus)：美國(guó)Schiff Nutrition Group公司產(chǎn)品；氦氣(純度99.999 9%)：北京北氧氣體有限公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)、甲酸(質(zhì)譜級(jí))：美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(長(zhǎng)10 cm，內(nèi)徑0.86 mm)：美國(guó)Sutter instrument公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1電噴霧電離分析條件 正離子模式，毛細(xì)管電壓3 000 V，基板電壓500 V，霧化氣壓力4.8×104Pa，干燥氣流速5 L/min，溫度180 ℃，注射泵進(jìn)樣速率5 μL/min。

1.3.2介質(zhì)阻擋放電電離分析條件 正離子模式，毛細(xì)管電壓1 000 V，基板電壓500 V，源內(nèi)溫度160 ℃，載氣流速2 L/min，電離源出口與錐孔夾角180°，樣品距錐孔0.5 cm，電離源出口距樣品0.5 cm，進(jìn)樣量2 μL，芬太尼類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液通過定量移液器滴加到硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管末端，毛細(xì)管末端與介質(zhì)阻擋放電電離源產(chǎn)生的等離子體邊緣相切。

1.3.3介質(zhì)阻擋放電電離源分析粉末樣品條件 正離子模式，毛細(xì)管電壓1 250 V，基板電壓500 V，源內(nèi)溫度220 ℃，載氣流速4 L/min，電離源與錐孔夾角135°，樣品距錐孔2.5 cm，電離源距樣品1 cm，用直徑6 mm的圓形雙面膠帶將0.5 mg粉末樣品粘于載玻片表面，介質(zhì)阻擋放電電離源產(chǎn)生的等離子體直接指向樣品表面進(jìn)行離子化[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子化方式的考察

通常情況下，質(zhì)譜圖中的碎片離子越多，提供的信息越豐富，越有利于分析目標(biāo)物質(zhì)的碎裂行為。本實(shí)驗(yàn)考察了ESI和DBDI兩種離子化方式對(duì)芬太尼類化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片離子數(shù)量和強(qiáng)度的影響。以芬太尼和對(duì)氟芬太尼為代表，按1.3.1和1.3.2節(jié)條件采集二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果示于圖2。使用DBDI與ESI檢測(cè)芬太尼所得的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2a。這兩種方式所得的質(zhì)譜圖中均可觀察到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(m/z337)與碎片離子峰[M+H-C9H10NO]+(m/z188)。此外，由哌啶環(huán)4號(hào)位連接的官能團(tuán)碎裂產(chǎn)生的[M+H-C3H5O]+(m/z281)和[M+H-C8H10O]+(m/z216)碎片離子[23]也可在兩種電離方式獲得的譜圖中觀察到。在DBDI下可以觀察到[M+H-H2O]+(m/z319)碎片離子，而在ESI譜圖中沒有，這可能是由芬太尼分子在等離子體作用下脫水產(chǎn)生的。使用兩種離子源采集對(duì)氟芬太尼的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2b。相比之下，DBDI質(zhì)譜圖中的碎片信息更豐富，除了準(zhǔn)分子離子峰(m/z355)、哌啶4號(hào)位基團(tuán)碎裂產(chǎn)生的碎片峰(m/z299、188)和哌啶環(huán)碎裂產(chǎn)生的[M+H-C8H10N]+(m/z234)外，還可觀察到m/z337脫水峰，以及可能由氟代苯基碎裂產(chǎn)生的碎片離子m/z285、269。

圖2 芬太尼(a)和對(duì)氟芬太尼(b)的介質(zhì)阻擋放電電離與電噴霧電離質(zhì)譜圖Fig.2 DBDI and ESI mass spectra of fentanyl (a) and p-fluorofentanyl (b)

可以看出，使用兩種離子化方式采集的芬太尼類化合物二級(jí)質(zhì)譜圖主要質(zhì)譜碎片信息基本一致。ESI方式下所得的碎片離子信號(hào)強(qiáng)度略高于DBDI，而DBDI可得到更多的碎片離子。這是由于DBDI通過電離載氣氦氣形成低溫等離子體，在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，待測(cè)物、載氣和空氣的電離產(chǎn)物均會(huì)在電場(chǎng)作用下進(jìn)入離子阱，在碰撞誘導(dǎo)解離過程中，待測(cè)物與電離氣體發(fā)生碰撞，從而產(chǎn)生比電噴霧電離種類更多的碎片離子。因此，采用DBDI更利于解析目標(biāo)化合物的碎裂模式。

2.2 介質(zhì)阻擋放電電離質(zhì)譜法分析芬太尼類化合物的碎裂模式

以DBDI為離子化方式，分別調(diào)節(jié)不同的碎裂電壓進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得了46種芬太尼類化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖、質(zhì)譜數(shù)據(jù)及碎裂電壓，基于化合物分子結(jié)構(gòu)與二級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息歸納碎裂模式。芬太尼類化合物大多是以取代基取代芬太尼上原有官能團(tuán)而制備的，因此芬太尼及其前體化合物的質(zhì)譜碎片特征可為總結(jié)芬太尼類化合物的裂解規(guī)律提供重要參考。芬太尼及其合成過程中常用原料N-苯乙基-4-哌啶酮和4-苯胺基-N-苯乙基哌啶的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子列于表1(序號(hào)1～3)。N-苯乙基-4-哌啶酮的主要特征碎片離子為m/z105，推測(cè)是由N-苯乙基-4-哌啶酮結(jié)構(gòu)中苯乙基與哌啶環(huán)之間的C—N鍵發(fā)生斷裂所致。4-苯胺基-N-苯乙基哌啶的主要特征碎片離子為m/z188，推測(cè)是4-苯胺基-N-苯乙基哌啶分子結(jié)構(gòu)中哌啶環(huán)與苯胺基之間的C—N鍵發(fā)生斷裂而形成的碎片離子。芬太尼的斷鍵位置和碎片離子示于圖3。芬太尼的裂解規(guī)律與兩種前體化合物相似，均可形成m/z188、105特征碎片離子，碎片離子m/z216則是由哌啶環(huán)內(nèi)部的C—N鍵發(fā)生斷裂而產(chǎn)生。此外，m/z188碎片伴隨質(zhì)量數(shù)為149 u的特征中性丟失。

圖3 芬太尼可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Proposed mass spectrometric fragmentation pattern of fentanyl

當(dāng)芬太尼發(fā)生取代反應(yīng)時(shí)，根據(jù)取代反應(yīng)發(fā)生位置的不同會(huì)產(chǎn)生不同的碎片離子，但其主要斷裂規(guī)律不會(huì)發(fā)生改變，可分為兩類。1) 取代反應(yīng)發(fā)生在哌啶環(huán)和與哌啶N相連的苯乙基上，無論是單取代還是多取代反應(yīng)，這類化合物在碰撞誘導(dǎo)解離過程中均發(fā)生149 u的中性丟失，對(duì)應(yīng)的中性丟失碎片為N-苯丙酰胺(表1，序號(hào)4～16)。其他碎片離子的結(jié)構(gòu)類似于4-苯胺基-N-苯乙基哌啶，具體取決于取代基類型。以β-羥基芬太尼和順-3-甲基芬太尼為例，當(dāng)羥基的取代反應(yīng)發(fā)生在苯乙基時(shí)，質(zhì)子化的β-羥基芬太尼在碰撞誘導(dǎo)解離作用下失去羥基，產(chǎn)生m/z204特征碎片離子和質(zhì)量數(shù)為149 u的中性丟失碎片，示于圖4a；當(dāng)甲基的取代反應(yīng)發(fā)生在哌啶環(huán)上3號(hào)位時(shí)，其特征碎片離子為m/z202，同時(shí)產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)為149 u的中性丟失碎片，示于圖4b。類似地，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生在哌啶環(huán)上4號(hào)位時(shí)(表1，序號(hào)10)，該位置的空間位阻增大，穩(wěn)定程度降低。此時(shí)，只需使用較低的碰撞能量就可以發(fā)生解離，失去4號(hào)位取代基，繼而產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子。此后的碎裂模式與2號(hào)或3號(hào)位發(fā)生取代的芬太尼化合物類似，并會(huì)產(chǎn)生149 u的中性丟失碎片。2) 取代發(fā)生在N-苯丙酰胺基上時(shí)，無論是單取代還是多取代反應(yīng)，這類芬太尼化合物在碰撞誘導(dǎo)解離過程中連接在哌啶環(huán)4號(hào)位的所有基團(tuán)都會(huì)丟失，最終得到4-苯胺基-N-苯乙基哌啶特征碎片離子m/z188(表2，序號(hào)1～30)。以對(duì)氟芬太尼和呋喃芬太尼為例，當(dāng)N-苯丙酰胺基中的N-苯基發(fā)生氟原子取代時(shí)，其前體離子為m/z355，經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后獲得的主要特征碎片離子為m/z188，示于圖5a；當(dāng)N-苯丙酰胺基中的N-酰基發(fā)生呋喃取代時(shí)，經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后獲得的主要特征碎片離子同樣為m/z188，示于圖5b。

圖5 對(duì)氟芬太尼(a)和呋喃芬太尼(b)可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Proposed mass spectrometric fragmentation patterns of p-fluorofentanyl (a) and furanylfentanyl (b)

圖4 β-羥基芬太尼(a)和順-3-甲基芬太尼(b)可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Proposed mass spectrometric fragmentation patterns of β-hydroxyfentanyl (a) and cis-3-methylfentanyl (b)

表1 具有質(zhì)量數(shù)為149 u中性碎片丟失的芬太尼類化合物Table 1 Fentanyl analogues with neutral loss of 149 u

2.3 粉末樣品中芬太尼的測(cè)定

向空白藥品粉末中添加不同濃度的芬太尼，制備不同含量的空白添加樣品。分別以m/z337>188和m/z337>216作為定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，設(shè)定采集時(shí)間30 s，按1.3.3節(jié)條件測(cè)定，所得選擇離子監(jiān)測(cè)色譜圖示于圖6a。以信噪比3和10計(jì)算芬太尼的檢出限和定量限分別為0.5、1 mg/kg。以峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，在1～20 mg/kg濃度范圍內(nèi)進(jìn)行線性回歸，得到校準(zhǔn)曲線y=315.12x-54.94(r=0.999 3)，示于圖6b。制備質(zhì)量濃度為5 mg/kg 的芬太尼空白添加粉末樣品，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，測(cè)得其含量為4.96 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%。

注：a.選擇離子監(jiān)測(cè)色譜圖；b.校準(zhǔn)曲線圖6 介質(zhì)阻擋放電電離質(zhì)譜法分析固體粉末樣品中的芬太尼Fig.6 Analysis of fentanyl in solid powder samples using DBDI-MS

3 結(jié)論

本研究采用介質(zhì)阻擋放電電離質(zhì)譜法采集了46種芬太尼類化合物的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并歸納了質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時(shí)建立了粉末樣品中芬太尼的快速測(cè)定方法。通過對(duì)碎裂模式的總結(jié)與分類，有助于非靶向篩查潛在未知芬太尼類化合物，本方法可實(shí)現(xiàn)粉末樣品中芬太尼類化合物的快速定性定量分析。