謝佩斯，段曉琨，蔡宗葦

(1.香港浸會大學(xué)環(huán)境與分析國家重點實驗室，香港 999077；2.華質(zhì)泰科生物技術(shù)有限公司，北京 100102)

當(dāng)前，二維細胞培養(yǎng)技術(shù)被廣泛用于抗癌藥物試劑的體外測試[1]。然而，二維細胞不能模擬體內(nèi)組織三維結(jié)構(gòu)的特性，其生長特點和狀態(tài)與體內(nèi)細胞差別較大，這使得體外測試難以準(zhǔn)確地評價抗癌藥物的實際療效。動物模型能夠很好地模擬人體腫瘤的微環(huán)境，但實際操作耗時、耗費，使得依靠動物模型進行大規(guī)模的藥物篩選十分困難[2]。三維細胞培養(yǎng)是介于動物模型和二維細胞模型之間的一種技術(shù)[3]，其能夠較大程度地模擬體內(nèi)腫瘤細胞的生長環(huán)境，同時大幅度降低成本，易于實現(xiàn)藥物篩選的標(biāo)準(zhǔn)化。

在三維細胞模型中，腫瘤細胞球能很好地模擬實體瘤的生長狀態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)[4]。在生長初期，腫瘤細胞球和實體瘤的體積呈指數(shù)增長，隨后兩者的體積增長速度逐漸減緩，直至到達平臺期。在體積逐漸增大的過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣滲透性的限制，腫瘤細胞球逐漸形成了中心區(qū)域的細胞凋亡區(qū)和細胞靜止區(qū)，以及外圍區(qū)域的細胞增殖區(qū)[4]。同樣，在實體瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中也能發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖區(qū)和凋亡區(qū)。

質(zhì)譜成像能夠檢測多種生物樣本中生物分子的分布[5]。目前，已有多種電離技術(shù)應(yīng)用于質(zhì)譜成像分析中，主要包括二次離子質(zhì)譜電離(SIMS)、電噴霧解吸電離(DESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)[6]。其中，SIMS能夠提供高空間分辨率，然而由于該技術(shù)需要通過高能量的一次離子轟擊樣本，使其局限于小分子的檢測和分析。MALDI是一種軟電離技術(shù)，根據(jù)選擇基質(zhì)的不同，能夠同時對不同的小分子(例如，代謝物、藥物、脂質(zhì)分子)和大分子(例如蛋白)進行檢測[7]。與真空MALDI技術(shù)相比，大氣壓MALDI更容易實現(xiàn)同其他離子源的切換，能夠?qū)σ恍┱婵諣顟B(tài)下不穩(wěn)定的物質(zhì)和基質(zhì)進行分析，同時獲得更少的離子碎裂峰[8]。

有文獻[9-10]報道應(yīng)用真空MALDI技術(shù)檢測三維細胞內(nèi)的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的分布。例如，當(dāng)結(jié)腸癌HCT116細胞球暴露20.6 μmol/L伊立替康藥物后，在最初的6 h內(nèi)，藥物僅在外圍區(qū)有分布；隨著暴露時間的延長，24 h后，藥物逐漸滲透到細胞的全部區(qū)域[11]。另外，本課題組[12]最近開發(fā)了一種快速簡便制備3D細胞球冰凍切片的方法，即采用冰包裹細胞球并在冰層上包裹一層冰凍切片包埋劑(OCT)膠的策略，解決了傳統(tǒng)方法中明膠包裹多細胞球?qū)е录毎虿灰妆话l(fā)現(xiàn)的問題，同時保證了冰凍切片的完整性，該方法結(jié)合真空MALDI技術(shù)已應(yīng)用于內(nèi)源性脂質(zhì)分子和外源性物質(zhì)雙酚A在腫瘤細胞球內(nèi)的檢測。然而，目前未見應(yīng)用大氣壓MALDI技術(shù)研究細胞球內(nèi)代謝分子分布的報道。

基于此，本實驗擬利用大氣壓MALDI-串聯(lián)超高分辨質(zhì)譜檢測并分析三維腫瘤細胞球內(nèi)22種代謝小分子的分布。這些代謝小分子涉及三羧酸循環(huán)、甘油磷脂的合成和降解兩條代謝通路。希望為研究腫瘤微環(huán)境和腫瘤代謝提供參考，為開展原位質(zhì)譜成像研究提供方法支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

大氣壓MALDI源：美國MassTech公司產(chǎn)品；HPLC-Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；96孔超低吸附培養(yǎng)皿：美國Corning公司產(chǎn)品。

1640培養(yǎng)基、牛血清、0.25%雙抗：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿、異丙醇：德國Merck公司產(chǎn)品；羧甲基纖維素、基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB)、9-氨基吖啶(9AA)、反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亞丙烯基]丙二腈(DCTB)：美國Sigma公司產(chǎn)品；

1.2 二維和三維細胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細胞系HCT116生長于10 cm含有6 mL的1 640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。細胞在溫度37 ℃，含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基由89%培養(yǎng)基、1%雙抗和10%牛血清配制而成。細胞每2天傳1次代，傳3代后，制備細胞懸浮液，用細胞自動計數(shù)儀計算細胞密度。將計算好的細胞懸浮液加入96孔超低吸附板中，每孔加入200 μL細胞懸浮液，每孔細胞數(shù)為6 000個，放入細胞培養(yǎng)箱中。3天后，給細胞球換液，用排槍小心吸取100 μL舊液，加入100 μL新培養(yǎng)液。之后，每隔2天換1次液。細胞球生長第11天時，細胞直徑大于800 μm，準(zhǔn)備開始搜集細胞球用于代謝物的提取和成像樣品的制備。

1.3 脂質(zhì)的提取與分析

收取15個細胞球于2 mL離心管中，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞球3次，加入300 μL冰甲醇以及75 μL去離子水，加入一小勺鋼珠，在組織搗碎機中破裂細胞球。收集懸浮液于新的離心管內(nèi)，用液氮反復(fù)凍融5次后，加入225 μL氯仿，混勻后，再加入75 μL去離子水。將離心管渦旋1 min，室溫下放置5 min后，轉(zhuǎn)移至-6 ℃離心機中，在12 000 g離心力下離心15 min。取最下層液體，置于1.5 mL離心管內(nèi)，在冷凍干燥器中旋干，加入100 μL復(fù)溶劑(由65%乙腈，30%異丙醇和5%去離子水配制而成)，超聲儀內(nèi)超聲直至黃色脂質(zhì)沉淀完全溶解，然后在4 ℃以8 000 g離心力下離心5 min，取80 μL上清液至進樣小瓶中，待上機檢測。

采用C18反向色譜柱進行脂質(zhì)分離，流動相A為含有0.1%甲酸、10 mmol/L甲酸銨的異丙醇-乙腈混合液(90∶10，V/V)，B為含有0.1%甲酸、10 mmol/L甲酸銨的乙腈-水混合液(60∶40，V/V)，流速0.26 mL/min；進樣體積10 μL；梯度洗脫條件：0～1 min(30%A)，1～2 min(30%～45%A)，2～7 min(45%～70%A)，7～9 min(70%～85%A)，9～17 min(85%～100%A)，17～19 min(100%A)，19～20 min(100%～30%A)，20～24 min(30%A)；樣品溫度8 ℃，柱溫箱溫度50 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 200。將采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Lipidsearch 4.0軟件中，選定負模式搜索，母離子和子離子的質(zhì)量偏差設(shè)為1×10-5，離子加合形式選擇[M-H]-。

1.4 冰凍切片的制備和基質(zhì)的噴涂

三維腫瘤細胞球冰凍切片的制備：在樣品載物臺上滴加2%羧甲基纖維素，待液體冷卻形成冰塊后，置于冰凍切片機內(nèi)切割，直至冰塊表面形成完整的切面。用記號筆標(biāo)記樣品載物臺放置方向，取出樣品載物臺至機內(nèi)預(yù)冷臺面。用生理鹽水清洗細胞球3次，用預(yù)先修剪過的200 μL槍頭吸取細胞球，待細胞球落至槍頭底部時，將細胞球小心地轉(zhuǎn)移至冰塊上。由于冰塊上方的溫度很低，包有細胞球的液滴會被立即凍住。此時取出樣品載物臺至室溫，在冰凍的液滴周圍滴加OCT膠，放回冰凍切片機內(nèi)冷卻。待OCT膠冰凍后，將樣品載物臺按先前標(biāo)記的位置放好，進行切片。選擇切片厚度50 μm，快切至肉眼看到細胞球時，將切片厚度設(shè)置為14 μm，慢慢切割，直至切出含有細胞球的切片。將切片轉(zhuǎn)移至氧化銦錫(ITO)導(dǎo)電玻璃板上，放入真空干燥瓶內(nèi)，直至樣品抽干。

將DHB溶于純甲醇中，終濃度為15 g/L；將9AA溶于95%乙腈中，終濃度為 3 g/L；將DCTB溶于純二氯甲烷中，終濃度為5 g/L。用手動噴槍將基質(zhì)噴涂至載有細胞球的ITO玻璃板上，其中DHB、9AA、DCTB的噴涂量分別為150、45、40 mg。

1.5 質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的采集與處理

按照供貨商推薦的數(shù)值設(shè)置大氣壓MALDI參數(shù)，其中激光能量為30%，激光頻率為3 000 Hz，采集速率8 mm/min，采集方向為橫掃，行間距為20 μm。質(zhì)量掃描范圍m/z80～1 000，負離子掃描模式，離子傳輸管溫度350 ℃，噴霧電壓3.25 kV。

數(shù)據(jù)采集完成后，首先通過MSconvert軟件將原始文件格式轉(zhuǎn)換成imzML格式；然后將多行數(shù)據(jù)合并為一個完整的數(shù)據(jù)，并導(dǎo)入Sclislab2020軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。數(shù)據(jù)矯正模式為TIC，圖像顯示選擇weak denoising。為確認成像數(shù)據(jù)中對應(yīng)的質(zhì)荷比是何種物質(zhì)，首先將需要確認的質(zhì)荷比與脂質(zhì)分析得到的數(shù)據(jù)庫進行匹配，若匹配不上，則再與Lipidmap數(shù)據(jù)庫進行匹配。對于非脂質(zhì)分子化合物，則選擇與Metlin數(shù)據(jù)庫進行匹配。匹配的質(zhì)荷比偏差設(shè)置為1×10-5，離子加合形式選擇[M-H]-。

2 結(jié)果與討論

2.1 三維腫瘤細胞球區(qū)域分割分析

注：標(biāo)尺長度為500 μm圖1 三維細胞球的外層區(qū)質(zhì)譜圖(a)、區(qū)域分割分析(b)以及內(nèi)層區(qū)質(zhì)譜圖(c)Fig.1 Mass spectrum in the outer region of 3D cell spheroid (a), segmentation analysis (b) and mass spectrum in the centre region of 3D cell spheroid (c)

有研究[4]指出，隨著細胞球體積逐漸增大，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣越來越難滲透到細胞球內(nèi)部，這使得內(nèi)部的細胞開始逐漸不生長甚至發(fā)生凋亡，而細胞球外圍的細胞易于從培養(yǎng)基中獲取營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，因此它們有著較快的生長增殖速度[1]。為驗證這一說法，利用Sclislab2020軟件中的區(qū)域分割功能對細胞切片球進行分析。由于不同狀態(tài)的細胞代謝特征有著明顯差異，細胞球切片可以清晰地分為外圍黃色區(qū)域以及內(nèi)層藍色區(qū)域，其分別由2 192、1 538特征譜圖構(gòu)成，示于圖1b。

為了證明細胞球外圍區(qū)和內(nèi)層區(qū)代謝譜圖的差異，使用MSIreader軟件對細胞球外層和內(nèi)層的譜圖進行比較，譜峰范圍在m/z750～900之間。實驗發(fā)現(xiàn)，m/z887.560 5、885.549 6峰的信號強度在外圍區(qū)高于內(nèi)層區(qū)；m/z769.400 5、753.410 0峰的信號強度在內(nèi)層區(qū)高于外層區(qū)；而m/z835.525 0、788.525 4峰的信號強度在外層區(qū)和內(nèi)層區(qū)無明顯差異，示于圖1a，1c。這些峰在細胞球不同層間的信號強度差異在成像數(shù)據(jù)中得到了證明。

2.2 三羧酸循環(huán)中4種代謝物的空間分布

三羧酸循環(huán)是有氧呼吸第二階段發(fā)生的反應(yīng)，也可稱為Krebs循環(huán)或者檸檬酸循環(huán)，該反應(yīng)主要發(fā)生在線粒體基質(zhì)[13]。三羧酸循環(huán)可以將糖酵解過程中產(chǎn)生的丙酮酸氧化為二氧化碳，產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，促進氧化磷酸化。該代謝途徑在能量代謝過程中起著重要作用。據(jù)文獻[9,14]報道，DHB和9AA兩種基質(zhì)對能量代謝相關(guān)的小分子具有良好的信號響應(yīng)，因此本實驗選取了這兩種基質(zhì)進行實驗，結(jié)果列于表1?？梢园l(fā)現(xiàn)，在質(zhì)荷比偏差小于1×10-5范圍內(nèi)，蘋果酸、草酰乙酸以及琥珀酸能夠在DHB基質(zhì)中檢測到，而α-酮戊二酸、蘋果酸以及琥珀酸能夠在9AA基質(zhì)中檢測到，這表明不同基質(zhì)對不同物質(zhì)的信號響應(yīng)有差異。三羧酸循環(huán)中的檸檬酸和延胡索酸代謝物沒有被檢測到。

表1 大氣壓MALDI串聯(lián)四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜儀檢測到的代謝小分子信息Table 1 Information of metabolites detected by an atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization-quadrupole-exactive-focus mass spectrometry platform

本課題組發(fā)現(xiàn)[10]，低劑量的雙酚S暴露能夠顯著促進乳腺癌三維細胞球增殖，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析表明，三羧酸循環(huán)通路中蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸以及延胡索酸的含量水平發(fā)生了顯著性地上調(diào)。然而，使用真空MALDI飛行時間(TOF)質(zhì)譜儀以及相同的基質(zhì)并沒有檢測到細胞球內(nèi)三羧酸循環(huán)中相關(guān)的代謝物。本實驗采用的高分辨四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜儀的檢測靈敏度和質(zhì)量分辨率優(yōu)于飛行時間質(zhì)譜儀。進一步的成像分析數(shù)據(jù)顯示，檢測到的4種代謝物均分布于細胞球的全部區(qū)域，表明它們在不同細胞狀態(tài)下的代謝水平?jīng)]有顯著性差別，示于圖2。

2.3 甘油磷脂的空間分布

甘油磷脂是一類主要參與維持細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的生物分子，在維持機體的生命活動中起著重要作用[15]。根據(jù)極性頭部取代基團的不同，可將甘油磷脂分為磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)、磷脂酸(phosphatidic acid, PA)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)和磷脂酰甘油(phosphati-dylglycerol, PG)等。為了研究甘油磷脂分子在細胞球內(nèi)的分布，在負離子模式下選用DCTB基質(zhì)進行實驗。在質(zhì)荷比偏差小于1×10-5范圍內(nèi)，檢測到了18種脂質(zhì)分子，包括6種PI，5種PA，1種PE，2種溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)，1種溶血磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositol, LPI)，2種磷脂酰甘油磷酸(phosphatidylglycerol phosphate, PGP)和1種PG。在6種PI中，有3種分布在全區(qū)域，2種分布在外圍區(qū)，1種分布在內(nèi)層區(qū)；在5種PA中，有4種分布在外圍區(qū)，1種分布在全區(qū)域；1種PE(18∶1/22∶6)分布在全區(qū)域；在LPA中，LPA(O-18∶2)分布在全區(qū)域，而LPA(20∶1)分布在內(nèi)層區(qū)；1種LPI(18∶0)分布在全部區(qū)域；在PGP中，PGP(O-30∶3)和PGP(30∶2)均分布在內(nèi)層區(qū)；1種PG分布在外圍區(qū)，示于圖3。以上數(shù)據(jù)與區(qū)域分割分析的數(shù)據(jù)吻合，表明甘油磷脂在三維細胞球內(nèi)的空間分布具有多樣性。

本課題組[12]對使用真空MALDI-TOF儀研究三維細胞內(nèi)的脂質(zhì)分布進行了報道。本實驗數(shù)據(jù)也表明了甘油磷脂的分布具有空間多樣性，例如，發(fā)現(xiàn)PE(18∶0/20∶4)分布在細胞球的外圍區(qū)，PI(18∶0/18∶1)分布在內(nèi)層區(qū)，PE(16∶0/18∶1)則分布在全部區(qū)。這可能是由于甘油磷脂不僅在維持細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能方面起作用，還參與細胞內(nèi)其他的生物過程，例如細胞的增殖和凋亡[15]。據(jù)報道，棕櫚油酸能夠通過PI生物合成通路選擇性地與PI結(jié)合，從而引起細胞的增殖[16]。LPA能夠與鞘氨醇-1-磷酸協(xié)同促進G蛋白通路，提供LPA和鞘氨醇-1磷酸受體，從而影響細胞存活[17]。

注：標(biāo)尺長度為500 μm圖2 三羧酸循環(huán)中代謝物離子在三維細胞內(nèi)的空間分布圖，以及代謝物離子在三維細胞內(nèi)層和外層的信號強度箱線圖Fig.2 Ion images of metabolites in TCA cycle and box-and-whisker plots corresponding to the intensity of metabolites in the centre and outer regions of 3D cell spheroids

注：標(biāo)尺長度為500 μm圖3 不同脂質(zhì)離子在三維細胞內(nèi)的空間分布圖，以及對應(yīng)脂質(zhì)離子在三維細胞內(nèi)層和外層的信號強度箱線圖Fig.3 Ion images of different lipids and box-and-whisker plots corresponding to the intensity of different lipids in the centre and outer regions of 3D cell spheroids

2.4 代謝通路聯(lián)合分析

通過代謝網(wǎng)絡(luò)分析，本實驗分析檢測的22種代謝物主要涉及三羧酸循環(huán)通路、甘油磷脂的合成和分解通路兩種代謝途徑，示于圖4。在三羧酸循環(huán)中，丙酮酸進入線粒體基質(zhì)后發(fā)生氧化，與輔酶A反應(yīng)生成乙酰輔酶A、還原型輔酶I和二氧化碳。甘油三磷酸在乙酰輔酶A和甘油三磷酸脂肪酸轉(zhuǎn)移酶的共同作用下生成LPA，繼續(xù)通過一系列的合成通路生成其他不同類型的甘油磷脂(例如，PA、PG、PE和PI)。甘油磷脂也可以通過分解通路生成溶血甘油磷脂(例如LPI)。在生物體內(nèi)，甘油磷脂的合成與分解之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡確保了生命活動的有序進行。

圖4 三羧酸循環(huán)(a)和甘油磷脂合成及降解(b)的代謝通路Fig.4 Pathways of TCA cycle (a) and biosynthesis and degradation of glycerophospholipids (b)

3 結(jié)論

本實驗建立了大氣壓MALDI串聯(lián)四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜法原位檢測三維腫瘤細胞球內(nèi)的代謝物，分析了22種內(nèi)源代謝物在細胞球內(nèi)的空間分布，包括4種涉及三羧酸循環(huán)的代謝物以及18種涉及甘油磷脂合成和分解的脂質(zhì)分子。結(jié)果表明，三羧酸循環(huán)中，4種代謝物分布在細胞球的全部區(qū)域。在甘油磷脂合成和分解通路中，脂質(zhì)分子在細胞球的中心區(qū)域、外圍區(qū)域和全部區(qū)域均有分布。區(qū)域分割分析數(shù)據(jù)表明，外圍區(qū)域和中心區(qū)域內(nèi)的細胞代謝特征有明顯差異。本工作可為研究腫瘤內(nèi)分子代謝機制提供思路，也可為利用分子成像技術(shù)探究藥物對腫瘤細胞的作用機制提供方法參考。