許美霞，周 賢，戴 仲，劉 濤，許 濤

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院重癥醫(yī)學科，武漢 430034)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)病死率與肺纖維化的程度密切相關(guān)，在ARDS的早期即有肺纖維化的發(fā)生，針對ARDS早期纖維增生的治療是改善ARDS預(yù)后的重要措施[1-5]。在細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶、抗蛋白酶和炎癥介質(zhì)相互作用下，肺成纖維細胞異常增生，導致膠原合成增加，是ARDS患者發(fā)生肺纖維化的重要機制[1-3]。本研究從ARDS肺纖維化的發(fā)病機制出發(fā)，研究細胞增殖抑制基因(HSG，又稱線粒體融合蛋白2，Mfn2)是否可通過抑制成纖維細胞的增生成為防治ARDS肺纖維化的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人胚肺成纖維細胞(HELF)購自中國科學院細胞資源庫。內(nèi)毒素(LPS)購自美國Sigma公司(批號14391)；rMnf2多克隆抗體(來源于雞)和抗雞二抗購自GenWay Biotech Inc公司；考馬斯亮藍法蛋白試劑盒及Sircol膠原測定試劑盒購自英國Biocolor公司。

1.2 方法

1.2.1人胚肺成纖維細胞(HELF)的培養(yǎng)

將凍存的HELF活化后，用含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，12 h后更換新培養(yǎng)基。待細胞生長貼壁率達80%以上后進行消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，選取細胞狀態(tài)良好的HELF進行實驗。

1.2.2LPS誘導HELF產(chǎn)生膠原

HELF常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞，予以不同濃度LPS(0.5、1、5、10 μg/mL LPS)刺激HELF，在各個時間點Sircol膠原測定試劑盒檢測細胞內(nèi)膠原蛋白水平。

1.2.3實驗分組

將HELF分為對照組，LPS組，LPS+Adv-vector組，LPS+Adv-Mfn2組。(1)對照組：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)LPS組：給予5 μg/mL LPS+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。(3)LPS+Adv-vector組：腺病毒載體Adv-vector及LPS、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。(4)LPS+Adv-Mfn2組：腺病毒載體Adv-Mfn2及LPS、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4檢測細胞內(nèi)總蛋白及膠原蛋白水平

HELF細胞經(jīng)分組誘導處理后，用考馬斯亮藍法測定細胞內(nèi)總蛋白、Sircol膠原測定試劑盒測定膠原蛋白水平。細胞內(nèi)膠原蛋白水平(μg/mg Protein)=待測樣本的膠原含量(μg/mL)÷待測樣本的總蛋白水平(mg/mL)。

1.2.5Western blot檢測Mnf2蛋白表達情況

收集待測組織樣品，BCA試劑盒測定待測樣品蛋白濃度。用5% BSA室溫封閉1 h。其中一抗用5%BSA封閉液按1∶200稀釋，4 ℃孵育過夜。二抗(辣根過氧化物酶標記的IgG)用5% BSA封閉液按1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h 。用ECL顯影。

1.2.6MTT法檢測HELF增殖情況

HELF細胞經(jīng)分組誘導處理后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT孵育4 h后去除培養(yǎng)基，加入DMSO 100 mL，溶解結(jié)晶體后，多功能酶標儀在波長570 nm處測量吸光度(A)值，A值的大小反映細胞的存活狀況。細胞存活率%=(給藥組A值-陰性對照組A值)/(陽性對照組A值-陰性對照組A值)×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度、不同作用時間LPS對HELF細胞內(nèi)膠原蛋白的影響

不同濃度的LPS處理HELF 24 h，用Sircol膠原測定試劑盒測定膠原蛋白水平，不同濃度的LPS組(0.5、1、5、10 μg/mL)膠原蛋白水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.028、0.011、0.000、0.000)，且膠原蛋白水平隨LPS濃度的增加呈增高趨勢，LPS以濃度依賴性誘導HELF產(chǎn)生膠原蛋白。組間比較，LPS組(5 μg/mL)與LPS組(1 μg/mL)比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，而LPS組(10 μg/mL)與LPS組(5 μg/mL)比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.68)，見圖1。

用終濃度為5 μg/mL的LPS刺激HELF，檢測LPS處理后不同時間(0、6、12、24、48 h)細胞內(nèi)膠原蛋白水平，不同時間的LPS組(6、12、24、48 h)膠原蛋白水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.031、0.000、0.000、0.000)，且膠原蛋白水平隨LPS刺激時間的增加呈增高趨勢，LPS以時間依賴性誘導HELF產(chǎn)生膠原蛋白。組間比較，LPS組(24 h)與LPS組(12 h)比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，而LPS組(24 h)與LPS組(48 h)比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.054)，見圖1。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組相比較。

2.2 各組細胞Mnf2蛋白表達的情況

用終濃度為5 μg/mL的LPS刺激HELF 24 h，Western blot檢測Mnf2蛋白表達的情況，LPS組較對照組Kv1.5蛋白表達明顯下調(diào)(P=0.000)；LPS+Adv-Mfn2組較LPS+Adv-vector組、LPS組Mnf2蛋白表達上調(diào)(P=0.000)，見圖2。

1:對照組；B:LPS組；3:LPS+Adv-vector組；4:LPS+Adv-Mfn2組；a：P<0.01，與對照組相比。

2.3 上調(diào)Mnf2表達對HELF增殖率及細胞內(nèi)膠原蛋白水平的影響

LPS組采用終濃度5 μg/mL的LPS刺激12、24、48 h后，HELF細胞增殖率分別為1.01±0.02、1.76±0.01、2.04±0.01，較對照組明顯增加(P<0.05)，而過表達Mnf2后， LPS+Adv-Mfn2組細胞增殖率分別為0.93±0.06、1.48±0.03、1.76±0.01，較LPS組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

LPS組(終濃度5 μg/mL，刺激時間12、24、48 h)細胞內(nèi)膠原蛋白水平分別為73.39±0.30、76.01±0.22、76.90±0.30，較對照組顯著增加(P<0.05)； LPS+Adv-Mfn2組膠原蛋白水平分別為72.12±0.30、73.21±0.26、73.46±0.25，較LPS組顯著減少(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組HELF細胞增殖情況及細胞內(nèi)膠原蛋白水平變化

3 討 論

肺成纖維細胞增生、膠原蛋白合成增加是ARDS肺纖維化的關(guān)鍵因素[2]。肺內(nèi)膠原蛋白85%由肺成纖維細胞產(chǎn)生，膠原蛋白水平是肺纖維化程度的重要指標[6]。LPS是革蘭陰性桿菌(G-)細胞壁的特征性成分，其可以促進多種固有細胞及炎性細胞分泌細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，通過LPS作用于體外培養(yǎng)的炎性細胞，將產(chǎn)生的細胞因子或活化的炎性細胞碎片與肺成纖維細胞共同培養(yǎng)，可誘導成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白增加[7-8]。本研究以不同濃度及時間LPS作用于HELF，與對照組比較膠原蛋白水平明顯增加，證實LPS以濃度及時間依賴性誘導HELF產(chǎn)生膠原蛋白，作為ARDS肺纖維化細胞模型，成功地誘導了肺成纖維細胞膠原蛋白產(chǎn)生的增加。

Mfn2是我國學者陳光慧利用差異顯示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個新基因。研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2能夠通過抑制Ras-Raf-ERK/MAPK信號通路的激活，增加細胞周期蛋白(CDK)抑制因子p21或p27的表達，降低視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)的磷酸化，使低磷酸化、抑制增殖的Rb蓄積，從而阻止G1/S期轉(zhuǎn)換，使細胞周期阻滯在G1/G0期，從而抑制細胞增殖[9-10]。在腫瘤和血管狹窄性疾病研究中，Mfn2在抑制腫瘤細胞和血管平滑肌細胞生長、誘導細胞凋亡發(fā)揮重要作用，阻止其異常增生，是近年來調(diào)控腫瘤生長轉(zhuǎn)移和血管狹窄性病理生理過程的重要靶點[11-14]。除此之外，WANG等[15]發(fā)現(xiàn)在盆腔器官脫垂患者子宮骶韌帶中提取的成纖維細胞中Mfn2表達水平升高，Mfn2可通過Ras-Raf-ERK信號通路抑制成纖維細胞的增殖和前膠原蛋白水平。ARDS肺纖維化涉及成纖維細胞異常增殖。因此，本研究推測Mfn2功能狀態(tài)可能與ARDS肺纖維化密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Mnf2蛋白在人胚肺成纖維細胞中存在表達，且LPS刺激后Mnf2蛋白表達下調(diào)，肺成纖維細胞增生，膠原蛋白產(chǎn)生增加，提示Mnf2蛋白可能與LPS誘導的ARDS肺纖維化有關(guān)。

為進一步證實Mnf2蛋白與ARDS肺纖維化的關(guān)系，通過轉(zhuǎn)染腺病毒Adv-Mfn2，過表達Mnf2蛋白，觀察成纖維細胞增殖情況及膠原蛋白產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)予以過表達Mnf2蛋白后，成纖維細胞增殖明顯減少，細胞內(nèi)蛋白總量及膠原蛋白水平明顯降低。因此可推斷過表達Mnf2蛋白，可減輕成纖維細胞增生，減少膠原蛋白的產(chǎn)生。

綜上所述，LPS作用于成纖維細胞后，Mnf2蛋白表達下調(diào)，膠原蛋白產(chǎn)生增加，而上調(diào)Mnf2蛋白表達可減輕LPS導致的成纖維細胞增生，減少膠原蛋白的產(chǎn)生。證實Mnf2蛋白可能在ARDS肺纖維化中發(fā)揮重要作用。