王雷 李盛華

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)屬中醫(yī)“骨枯、骨痿”范疇，是絕經(jīng)后女性的一種常見病、多發(fā)病。其機(jī)理在于絕經(jīng)后雌激素水平顯著降低，骨代謝紊亂并處于負(fù)平衡狀態(tài)，從而表現(xiàn)為以全身性骨量減少，單位體積骨量降低以及骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的全身代謝性疾病[1]。目前治療PMOP的藥物主要以雌激素替代療法、鈣劑和雙膦酸鹽為主，但長期使用也存在著不良反應(yīng)大或療效欠佳等問題[2]。基于辨證論治運用六味地黃丸治療本病盡管其療效確切，但其治療PMOP的藥理機(jī)制網(wǎng)絡(luò)仍難以完全闡述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一個新的交叉學(xué)科，通過多個數(shù)據(jù)庫構(gòu)建藥物活性成分-靶點-疾病靶點-PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而從分子水平闡釋藥物治療疾病的作用機(jī)理,值得借鑒與應(yīng)用。

六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，由熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成。方中熟地黃滋陰補(bǔ)腎，填精益髓，為君藥；山茱萸補(bǔ)肝益腎，山藥補(bǔ)益脾陰，亦能固腎，共為臣藥。三藥相配，肝脾腎三陰并補(bǔ)，稱為“三補(bǔ)”。澤瀉利濕泄?jié)嶂嗖⒎朗斓攸S之滋膩；茯苓淡滲利濕并助山藥之健運；丹皮清泄虛熱，并制山茱萸之溫澀。稱為“三泄”，均為佐藥。三補(bǔ)三泄，以補(bǔ)為主，三陰并補(bǔ)，以腎為要，全方精煉，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，諸藥合用，共奏滋陰補(bǔ)腎、填精益髓之功。本研究在臨床試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對六味地黃丸活性成分、靶點及信號通路進(jìn)行探析，討論其可能的作用機(jī)制，以期為六味地黃丸治療PMOP提供進(jìn)一步理論參考。

1 資料與方法

1.1 臨床試驗方案

1.1.1一般資料：選取2017年1月至2019年1月在甘肅省中醫(yī)院就診的60例腎陰虛證PMOP患者作為研究對象，隨機(jī)分為治療組和對照組。其中治療組年齡61～72歲，平均(64.1±2.7)歲；病程4～10年，平均病程(7.2±2.3)年；體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)為16.3～27.8 kg/m2，平均(22.4±1.6) kg/m2；絕經(jīng)時間5～18年，平均(9.3±1.4)年；對照組年齡60～68歲，平均(62.9±2.3)歲；病程5～9年，平均病程(6.8±2.1)年；BMI為16.6～27.4 kg/m2，平均(22.1±1.7) kg/m2；絕經(jīng)時間6～17年，平均(9.1±1.5)年；兩組皆存在部分患者曾經(jīng)有脆性骨折，研究期間無骨折。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(2015)制定[3]：①自然絕經(jīng)時間>2年的女性；②DXA測定骨密度T值≤-2.5SD，結(jié)合全身疼痛、脊柱變形等臨床癥狀予以診斷并納入試驗。③辨為腎陰虛證：腰背疼痛或者全身性疼痛，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，伴有頭暈，耳鳴耳聾，舌紅、苔少，脈沉細(xì)[4]。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)；②存在對本試驗用藥禁忌者；③已接受其他方案或正參與其他臨床研究者；④不愿接受我科治療方案者；⑤合并嚴(yán)重的心、肝、腎等全身疾病不能持續(xù)觀察者；⑥嚴(yán)重精神障礙患者。

1.1.4治療方法：兩組患者均給予維生素D和鈣劑，治療組同時給予六味地黃丸(北京同仁堂，國藥準(zhǔn)字Z19993068)口服，8丸/次，3次/d；對照組給予鹽酸雷洛昔芬片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050899)口服，每次60 mg/次，1次/d。療程6個月。

1.1.5檢測指標(biāo)：治療前后腰椎(L1～4)及右側(cè)股骨頸密度值，血清骨鈣素(OCN)及血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)水平。OCN與TRAP-5b正常參考值分別為4.8～10.2 μg/L、2.34～4.04 U/L，所有檢測均重復(fù)3次。

1.2 六味地黃丸活性成分及靶點挖掘

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索每味中藥的活性成分，依據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18篩查出符合條件的活性成分，對不滿足篩查要求但含量高或者活性強(qiáng)的活性成分給予手動添加。再依據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫將活性成分與潛在靶點逐一配對，運用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，篩選物種為“Homo sapiens”的靶點，作為六味地黃丸活性成分靶點。

1.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點獲取

以“Postmenopausal osteoporosis、osteoporosis”為檢索詞分別從OMIM(http：//www.omim.org)、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、Genecards(https://www.genecards.org)3個數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)靶點，重復(fù)靶點保留1 個，所得靶點即為PMOP靶點。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將六味地黃丸活性成分靶點與PMOP靶點取交集，并與六味地黃丸活性成分一一對應(yīng)。采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建活性成分與交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖。將交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度“highest confidence(0.9)”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)信息，再運用Cytoscape3.7.2軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)作可視化處理。以介數(shù)(Betweenness)和自由度(Degree)的均值作為截點，將截點之上的靶點視為主要靶點，分析其藥理作用。

1.5 GO富集及KEGG信號通路富集分析

將篩選出的主要靶點輸入到Metascape數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行GO生物過程富集和KEGG信號通路富集分析。依據(jù)富集基因數(shù)選取前20位生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)和KEGG信號通路。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察指標(biāo)

治療前兩組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后兩組患者腰椎(L1～4)、右側(cè)股骨頸骨密度值及OCN水平均高于治療前，TRAP-5b水平低于治療前(P<0.05)；治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)，見表1～3。

表1 兩組患者治療前后骨密度值比較Table 1 Comparison of bone mineral density between the two groups

表2 兩組患者治療前后骨密度差值比較Table 2 Comparison of the difference of bone mineral density between the two groups before and after the treatment

表3 兩組患者治療前后骨代謝指標(biāo)比較Table 3 Comparison of bone metabolism indexes between the two groups

2.2 六味地黃丸活性成分及靶點的篩選結(jié)果

六味地黃丸的活性成分共有608個，依據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合手動篩選結(jié)果，得到74個活性成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中將其與潛在靶點逐一配對，重復(fù)靶點僅保留1個，共得到181個靶點。

2.3 PMOP靶點獲取結(jié)果

重復(fù)靶點保留1個，從OMIM、Drugbank及GeneCards 3個數(shù)據(jù)庫中共得到1 127個靶點。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

將181個活性成分靶點與1 127個PMOP靶點進(jìn)行映射，得到96個共同靶點，見圖1，對應(yīng)36個六味地黃湯候選活性成分，見表4。利用 Cytoscape3.7.2軟件建立活性成分與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有132個節(jié)點和220條邊，見圖2。靶點數(shù)位居前3位的活性成分為槲皮素、山奈酚、兒茶素，推測可能是六味地黃丸發(fā)揮促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的主要活性成分，見表5。

圖2 六味地黃丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Active components-target network of Liuwei Dihuang pills

表4 六味地黃丸活性成分基本信息Table 4 Basic information of active components

表5 六味地黃丸主要活性成分基本信息Table 5 Basic information of main active components

圖1 六味地黃丸與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram analysis of Liuwei Dihuang pills and postmenopausal osteoporosis targets

為了進(jìn)一步研究六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，將96個交集所得靶點進(jìn)行 PPI網(wǎng)絡(luò)分析，見圖 3，網(wǎng)絡(luò)中所有靶點均可以發(fā)生相互作用，產(chǎn)生了1 693條代表蛋白間相互作用的邊，篩查出自由度和介數(shù)均超過平均值的靶點為干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF1)、抑瘤素M(OSM)、白介素6(IL-6)，認(rèn)為其可能是六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要靶點。

圖3 六味地黃丸PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The PPI network of targets

2.5 GO富集及KEGG信號通路富集結(jié)果

GO富集分析結(jié)果見圖4，其中分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面。生物過程主要涉及到細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路等生物過程。細(xì)胞組成則包括了蛋白激酶復(fù)合物、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、線粒體外膜等方面。KEGG信號通路富集分析結(jié)果，見圖5，有3條信號通路與PMOP密切相關(guān)，分別是JAk-STAT、Wnt及NF-κB信號通路，提醒筆者六味地黃丸能夠通過多途徑作用于PMOP。以NF-κB信號通路為例，六味地黃丸治療PMOP的潛在靶點和作用機(jī)制見圖6。

圖4 六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵靶點的GO富集分析圖Fig.4 GO enrichment analysis of key target of Liuwei Dihuang pills against postmenopausal osteoporosis

圖5 六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥預(yù)測靶點的KEGG通路富集分析圖Fig.5 KEGG pathway enrichment of predicted targets of Liuwei Dihuang pills against postmenopausal osteoporosis

圖6 六味地黃丸作用于NF-κB信號通路的潛在靶點和作用機(jī)制Fig.6 Potential targets and mechanism of Liuwei Dihuang pills on NF-κB signaling pathway

3 討論

中藥復(fù)方具有藥味多、途徑多、靶點多及成分復(fù)雜的特點，用傳統(tǒng)方法研究確有一定難度，這也是目前對其機(jī)理認(rèn)識還比較模糊的原因。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為連接中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁，能夠?qū)⒍哂行诤掀饋?，使中藥?fù)方的作用機(jī)制從分子水平解釋成為可能。由臨床研究可知六味地黃丸能夠明顯增加PMOP患者的骨密度、升高骨形成指標(biāo)、降低骨吸收指標(biāo)，但其作用機(jī)制仍難以完全闡明。因此在臨床研究的基礎(chǔ)上筆者應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多個數(shù)據(jù)庫，探析六味地黃丸治療PMOP的作用機(jī)制。

依據(jù)六味地黃丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)可知槲皮素、山奈酚及兒茶素是治療PMOP的主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明[5-6]槲皮素在BMSCs的增殖及骨向分化方面具有重要的促進(jìn)作用。也有學(xué)者指出[7-8]槲皮素是一種天然的植物雌激素，具有促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的活性，這可能是槲皮素能夠治療PMOP的機(jī)理所在。雷曉青等[9]證實山奈酚具有顯著的雌激素樣活性，對成骨細(xì)胞的增殖及分化作用明顯。同時，丁淑琴等[10]發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠抑制去卵巢大鼠骨吸收及鈣丟失。兒茶素主要分為4種，其中兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與骨質(zhì)疏松關(guān)系緊密，多位學(xué)者通過實驗發(fā)現(xiàn)[11-12]EGCG可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化?？梢娏兜攸S丸主要通過促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收發(fā)揮作用。

六味地黃丸治療PMOP的主要靶點有3個，有學(xué)者指出[13]IRF1對骨代謝具有調(diào)控作用，其機(jī)理在于其參與OB和OC的成熟與分化。OSM屬于IL-6家族，對骨骼系統(tǒng)作用明顯，有研究發(fā)現(xiàn)[14-16]OSM通過調(diào)節(jié)骨形成和吸收，對維持骨穩(wěn)態(tài)，調(diào)控骨組織重建和修復(fù)具有重要的作用。于雪冰等[17]證實六味地黃丸在顯著上調(diào)IRF1、OSM基因的同時可提高PMOP患者的骨密度，促進(jìn)合成OCN，筆者分析與IRF1、OSM的上調(diào)有關(guān)。IL-6是重要的骨代謝調(diào)節(jié)者，可促進(jìn)成骨分化，而其機(jī)制是通過激活JAK/STAT信號通路發(fā)揮作用[18]。當(dāng)然其他靶點如Runx2，作為調(diào)控成骨分化的重要因子，有研究確認(rèn)[19]低表達(dá)的Runx2可能是PMOP發(fā)病的一個重要因素，而上調(diào)Runx2則能夠有效升高骨密度，這一結(jié)論與胡流超等[20]的研究結(jié)果相一致。有文獻(xiàn)指出[21]雌激素能顯著提高去勢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，同時降低TRACP-5b含量，這與ESR1的參與密切相關(guān)，也與本臨床試驗的結(jié)論也相符合。也有學(xué)者[22-23]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析活血、溫補(bǔ)腎陽與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，所得靶點比較有異有同，但臨床療效確切。

GO生物過程富集分析中，分子功能與生物過程富集分析的結(jié)果與PPI網(wǎng)絡(luò)分析的規(guī)律相一致，也與PMOP發(fā)病機(jī)制相符合；PMOP相關(guān)基因富集于該過程，引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。而參與富集的基因多為六味地黃丸所涉及的基因，由此可見六味地黃丸通過調(diào)控該過程，可以達(dá)到治療PMOP的目的。

從KEGG通路富集分析可知與PMOP明顯相關(guān)的通路有3條。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[24]六味地黃丸通過調(diào)控JAK/STAT通路中相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與骨代謝，這與于雪冰等[17]研究的結(jié)論相呼應(yīng)。也有研究證實[25]干擾素通過JAk-STAT信號通路可以調(diào)控破骨細(xì)胞分化，PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭悬cIL-6亦通過該通路發(fā)揮作用。Wnt信號通路在骨代謝中具有重要的作用，其經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞形成。也有學(xué)者指出[26-28]隨著機(jī)體的衰老，線粒體加劇損傷，氧化與抗氧化作用失衡，NF-κB信號通路被激活，成骨細(xì)胞的增殖、分化能力降低的同時，破骨細(xì)胞的吸收能力得到增強(qiáng)，從而加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展。有文獻(xiàn)證實[29]NF-κB信號通路與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在多方面具有重要的聯(lián)系，敲除p50/p52基因的小鼠，破骨細(xì)胞無法形成，而成骨細(xì)胞增多。由此提示六味地黃丸通過多個途徑作用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的目的。

綜上所述，本研究基于辨證論治在臨床研究的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對六味地黃丸作用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥多成分、多靶點間的相互關(guān)系及作用機(jī)制進(jìn)行深入探析，回答了臨床一線應(yīng)用六味地黃丸治療PMOP的疑問，并對其作用機(jī)制通過新的范式提供了理論依據(jù)，為深入探索六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有重要的參考意義。