丁瑞恒 羅瑩

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院，北京 100038

2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種代謝性骨病，特征是骨量減少、骨組織的微結(jié)構(gòu)異常和骨脆性增加[1-2]。其發(fā)病率隨人口老齡化逐年上升，現(xiàn)已成為普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前，臨床治療藥物僅限于改善癥狀以延緩病情的進(jìn)展，并且還報道了下頜骨壞死、非典型股骨骨折等不良反應(yīng)[3]，亟待探索新的藥物及治療思路。

穿心蓮(andrographis paniculata，AP)是一種傳統(tǒng)藥材，初步藥理研究證明其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑制血小板聚集等作用[4]，通常用于發(fā)熱、炎癥、腹瀉等感染性疾病，無明顯不良反應(yīng)。穿心蓮內(nèi)酯是AP的主要活性成分之一，在破骨細(xì)胞相關(guān)骨疾病的治療中有潛力[5-6]，但其作用機理仍然不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，該新興學(xué)科運用網(wǎng)絡(luò)可視化技術(shù)來揭示藥物、基因、靶點之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[7-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的關(guān)鍵步驟包括識別中藥的有效活性成分及各活性成分的作用靶點、篩選疾病的作用靶點、構(gòu)建“藥物成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)、富集分析等。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可預(yù)測和揭示藥物的作用機制，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費用。

在這項研究中，首先系統(tǒng)篩選了AP的活性化合物，并預(yù)測其可能的靶標(biāo)。同時，搜索了與OP相關(guān)的已知潛在靶標(biāo)，并進(jìn)行注釋和可視化。最后，借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯M(jìn)一步預(yù)測AP抗OP作用的候選目標(biāo)，并對靶點進(jìn)行通路富集和分析，以探討AP抗OP的分子機制。研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖Fig.1 The framework of this study

1 材料與方法

1.1 通過TCMSP鑒定活性化合物

使用關(guān)鍵詞“穿心蓮”從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索與其相關(guān)的所有活性化合物，得到化合物結(jié)構(gòu)、藥物口服生物利用度(oral bio-avaliability，OB)、藥物相似性(drug likeness，DL)、血腦屏障，水溶性等天然化合物的藥代動力學(xué)特性，用于評估該天然化合物的ADME特點[9]。DL是為從候選藥物中篩選具有適當(dāng)?shù)乃幋鷦恿W(xué)特征并過濾不良特性分子而提出的概念[10]。高OB通常是確定生物活性分子DL指數(shù)的關(guān)鍵指標(biāo)[11]。選擇OB≥30%和DL≥0.18的化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.2 通過PharmMapper識別潛在的藥物靶點

從PubChem下載上一步篩選出的候選化合物結(jié)構(gòu)的.sdf文件，并將其上傳到PharmMapper數(shù)據(jù)庫，選擇“僅人類蛋白質(zhì)靶標(biāo)”，其他參數(shù)應(yīng)用默認(rèn)值。選擇每個化合物排名前10位的潛在靶點并對結(jié)果做重復(fù)性篩查，剩余的蛋白質(zhì)靶點進(jìn)行下一步研究。

通過網(wǎng)絡(luò)成像軟件Cytoscape_3.6.1構(gòu)建和分析“活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)”，將以上獲得的活性成分和靶點導(dǎo)入軟件，網(wǎng)絡(luò)中“節(jié)點”(node)代表分子和靶蛋白，“邊”(edge)代表化合物與靶點之間的關(guān)系。

1.3 通過GeneCrads和CTD識別疾病相關(guān)靶標(biāo)

使用關(guān)鍵詞“osteoporosis”從GeneCrads和CTD數(shù)據(jù)庫中搜索和篩選已知的疾病靶點。用維恩圖刪除搜索結(jié)果中重復(fù)的靶點。

1.4 GeneMaNIA分析

為了討論AP與OP之間的關(guān)系，本研究提取了AP藥物預(yù)測靶點和OP疾病靶點共享的蛋白質(zhì)靶點，這些靶點的相互作用由GeneMANIA預(yù)測。選擇物種為“人類”，檢索目標(biāo)基因。通過可視化的蛋白質(zhì)互作關(guān)系，構(gòu)建AP治療OP的直接和間接目標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 通過DAVID作富集分析

將上述步驟獲得的潛在靶點上傳到DAVID 6.7服務(wù)器，選擇<0.05進(jìn)行功能注釋聚類。

1.6 Cytoscape的網(wǎng)絡(luò)建設(shè)

為了系統(tǒng)地了解AP對OP的治療，在Cytoscape_3.6.1[12]中構(gòu)建并分析靶點通路網(wǎng)絡(luò)之間的復(fù)雜關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮中的活性化合物

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到AP的49種化合物，最終選擇了符合DL≥0.18和OB≥30%的21種活性化合物(見表1)用于進(jìn)一步研究。

表1 穿心蓮的活性化合物Table 1 Active compounds in AP

2.2 AP的藥物靶點預(yù)測

將21種AP活性化合物導(dǎo)入PharmMapper，總共獲得206個相關(guān)的靶點蛋白，除重后保留109個靶點進(jìn)行下一步研究。AP的靶點預(yù)測網(wǎng)絡(luò)(見圖2)由130個node和206個edge組成，network centralization為0.062，average number of neighbors為3.169。該網(wǎng)絡(luò)包含一些具有high-Degree 和high betweenness centrality的化合物，這意味著它們連接多個靶蛋白，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要的意義。例如，MOL008239[槲皮素四甲基(3′，4′，5，7)醚]，MOL002928(木蝴蝶素A)和MOL008213(14-脫氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯)，degree均=10，betweenness centrality分別為0.132 50、0.094 86和0.093 58。

圖2 AP靶點網(wǎng)絡(luò)(藍(lán)色三角形：AP活性化合物；綠色倒三角形：蛋白質(zhì)靶點；連線：化合物與蛋白質(zhì)靶點之間的相互關(guān)系)Fig.2 Drug-target network (blue triangle: compound; green inverted triangle: protein target; edge: interaction between a compound and a protein)

2.3 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點

從Gene Cards和CTD數(shù)據(jù)庫查找OP相關(guān)的疾病靶點并去除重復(fù)后，得到與OP相關(guān)的691個靶點(見圖3)。

圖3 用維恩圖表示CTD和GeneCard之間的靶點關(guān)系(藍(lán)色代表從CTD中查找到的靶點數(shù)量，黃色代表從GeneCard中找到的靶點數(shù)量)Fig.3 Venn map between CTD and GeneCards (blue represents the numbers of CTD; yellow represents the numbers of GeneCards)

2.4 GeneMANIA 分析

提取AP預(yù)測作用靶點和OP相關(guān)靶點之間共有的36個靶點。這些靶點的互作由GeneMANIA預(yù)測。結(jié)果表明36個靶基因之間存在豐富的互作關(guān)系，共表達(dá)29.85%，參與物理相互作用的比例為30.72%(見圖4)。

圖4 GeneMANIA分析關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)(黑色節(jié)點：靶蛋白；彩色線條：節(jié)點之間不同的相互作用)Fig.4 Network of potential targets analyzed using GeneMANIA (black nodes: target proteins; colored lines: different interactions)

2.5 GO富集和KEGG分析

使用DAVID 6.7的功能注釋工具對上述36個關(guān)鍵基因進(jìn)行富集分析，挖掘它們參與的主要信號通路。主要參與的前5項生物過程是：對有機物的響應(yīng)、對內(nèi)源性刺激的響應(yīng)、對激素刺激的響應(yīng)及對細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(見圖5)。

圖5 目標(biāo)基因的Gene Ontology (GO) 分析Fig.5 Gene ontology (GO) analysis of therapy targets

共有22條通路與36個關(guān)鍵基因顯著相關(guān)，其中Adherens junction通路和MAPK通路可能和骨質(zhì)疏松疾病有直接關(guān)系(見表2)。

表2 關(guān)鍵蛋白的通路富集分析Table 2 KEGG pathway analysis of potential targets

本研究構(gòu)建了靶標(biāo)及其對應(yīng)的重要信號通路的網(wǎng)絡(luò)，以進(jìn)一步闡明分子機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其網(wǎng)絡(luò)由43個節(jié)點和112個交互組成(見圖6)。

圖6 AP的藥物靶點和通路網(wǎng)絡(luò)(藍(lán)色方塊：通路；粉色圓圈：靶點；連線：它們之間的相互作用)Fig.6 Target-pathway network for AP (blue square: pathway; pink circle: targets; edges: the interactions among them)

3 討論

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)來篩選穿心蓮活性成分。根據(jù)OB和DL參數(shù)篩選出穿心蓮的有效成分，建立了“有效成分-藥物靶點-疾病靶點”的功能關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析?；诜治鼋Y(jié)果，提示穿心蓮的入血活性成分之間存在協(xié)同作用，直接和間接在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的作用，具有治療骨質(zhì)疏松的潛力。

抗骨質(zhì)疏松藥物主要通過維持成骨細(xì)胞形成與破骨細(xì)胞吸收之間的平衡來實現(xiàn)骨骼的代謝穩(wěn)態(tài)。本研究富集分析的結(jié)果顯示，穿心蓮可能直接和間接地影響和調(diào)節(jié)骨骼代謝。穿心蓮直接影響骨代謝的途徑，有Adherens junction和MAPK信號通路傳導(dǎo)。已有研究表明，軟骨膜中成骨細(xì)胞之間通過N-鈣粘連蛋白Adherens junction信號傳導(dǎo)對于軟骨內(nèi)骨生長至關(guān)重要。Guntur等[13]研究了N-鈣粘連蛋白介導(dǎo)的黏附連接是否在骨發(fā)育過程中起作用，他們觀察到?jīng)]有β-連環(huán)蛋白的軟骨膜中黏附連接和AKT信號的減少，N-鈣粘連蛋白對成骨細(xì)胞間連接的調(diào)節(jié)受成骨細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的影響。MAPK信號通路對于骨骼發(fā)育和維持骨平衡具有重要作用[14-15]。ERK-MAPK信號傳導(dǎo)是成骨細(xì)胞在體外增殖分化以及體內(nèi)骨骼發(fā)育的主要組成部分[15]。

此外，本研究富集的信號通路中，有一些信號通路可調(diào)節(jié)其他系統(tǒng)從而間接影響骨代謝的平衡，如神經(jīng)營養(yǎng)因子、VEGF、ErbB、Toll樣受體、胰島素等信號通路。提示穿心蓮可通過神經(jīng)、循環(huán)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)的新陳代謝間接影響或干擾骨骼微環(huán)境，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖或抑制破骨細(xì)胞的生成。胰島素信號通路通過影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的發(fā)育，在骨骼的生長和更新中作用重大。成骨細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號傳導(dǎo)途徑受損，可影響成骨細(xì)胞的增殖、分化和存活，最終導(dǎo)致骨質(zhì)量受損[16]。

本研究表明，穿心蓮具有多種生物活性，可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛力藥物，目前其主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯已有一些研究的報道。穿心蓮內(nèi)酯具有激活經(jīng)典的Wnt信號通路的能力，這對于治療骨質(zhì)疏松癥至關(guān)重要[17]。穿心蓮內(nèi)酯可能通過上調(diào)ERK信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖[18]。穿心蓮內(nèi)酯可預(yù)防破骨細(xì)胞相關(guān)的骨吸收[5]，并抑制牙齦卟啉單胞菌引起的牙槽骨吸收[19]。穿心蓮內(nèi)酯可能通過激活成骨細(xì)胞中的Wnt/β-Catenin信號通路來促進(jìn)成骨潛力[13]。穿心蓮內(nèi)酯還可以通過阻斷鼠巨噬細(xì)胞中的NF-κB信號通路來抑制破骨細(xì)胞生成[20]，并通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路來促進(jìn)成骨分化[21]。此外，穿心蓮內(nèi)酯通過抑制RANKL信號通路來抑制卵巢切除術(shù)引起的骨丟失[22]。這些研究支持穿心蓮內(nèi)酯對骨骼代謝的直接影響。另一方面，有文獻(xiàn)還報道了穿心蓮內(nèi)酯對骨骼代謝的間接影響。Mittal等[23]報道穿心蓮內(nèi)酯與腺苷A2a受體結(jié)合以激活Nrf-2轉(zhuǎn)錄，并通過失活GSK-3β來抑制其從細(xì)胞核中的排斥，這些結(jié)果共同導(dǎo)致抗氧化酶血紅素加氧酶-1(HO-1)的激活，因此可以推測穿心蓮內(nèi)酯可以用作對抗與氧化應(yīng)激有關(guān)的各種疾病，例如骨質(zhì)疏松癥。此外，穿心蓮片對圍絕經(jīng)期牙周炎患者的骨代謝和內(nèi)分泌都具有調(diào)節(jié)作用，療效高并且安全[24]。

綜上所述，穿心蓮的有效活性成分可用于骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中多靶點和多系統(tǒng)的綜合干預(yù)。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析藥物與疾病靶標(biāo)之間的互作關(guān)系，可以為進(jìn)一步優(yōu)化骨質(zhì)疏松癥臨床治療的實驗設(shè)計提供重要的研究依據(jù)，并為藥物開發(fā)提供新思路。