張波 朱鳴鏑 姚晨 張亞峰

南通大學附屬醫(yī)院骨科，江蘇 南通 226000

骨質(zhì)疏松癥為發(fā)病率居于第三位的慢性疾病，患者骨量丟失、呈疏松狀變化，強度降低、骨質(zhì)變脆，可引起疼痛等全身性骨病，受到較小創(chuàng)傷即可能發(fā)生骨折，嚴重者甚至導致殘疾、死亡[1]。絕經(jīng)后更年期女性由于激素紊亂等，骨質(zhì)更易發(fā)生疏松，據(jù)統(tǒng)計，更年期女性骨密度以每年2.5%的速度下降[2]。臨床一般采用雌激素進行治療，可有效促進骨形成并抑制骨吸收，然而可能增加心血管疾病及子宮內(nèi)膜病變發(fā)生風險[3-4]。因此，尋找不良反應低的藥物十分必要。臨床用于治療高血壓等疾病的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enginease inhibitor，ACEI)類藥物，臨床發(fā)現(xiàn)，ACEI可提高高血壓患者骨密度，改善骨質(zhì)疏松，減低骨折風險[5-6]。動物實驗同樣觀察到ACEI可有效抑制雌激素缺乏所致骨密度降低，加速骨骼愈合[7]。然而也有研究者指出，ACEI可能加速骨丟失，建議謹慎使用該類藥物[8]。為明確ACEI對絕經(jīng)女性骨質(zhì)疏松的影響，本研究通過構(gòu)建去卵巢(ovariectomized，OVX)大鼠模型，觀察ACEI卡托普利對骨密度及微結(jié)構(gòu)的影響并探究其作用機制，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡健康SD大鼠，均為雌性，體重300～320 g，購自百奧賽圖江蘇基因生物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(蘇)2016-0004)。經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準后遵守3R原則進行所有實驗。

1.2 主要試劑及儀器

卡托普利片(規(guī)格：12.5 mg，國藥準字H20067928)購自世康特(上海)制藥有限公司，己烯雌酚片(規(guī)格：0.5 mg，國藥準字H31020555)購自信誼天平(上海)藥業(yè)有限公司；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、緩激肽受體1(bradykinin 1 receptor，B1R)小鼠源抗體(貨號：sc-137087、sc-390351、sc-293196)購自美國Santa cruz公司，組織激肽釋放酶(tissue kallikrein，KLK)及緩激肽(BK)小兔源抗體(貨號：ab131029、ab47864)購自美國abcam公司；β-actin小鼠源抗體、羊抗兔、馬抗小鼠IgG抗體(貨號：3700S、7074S、7076S)購自美國CST公司；大鼠Ⅰ型前膠原N-端肽(procollagen type I N-terminal propeptide，PINP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)ELISA試劑盒(貨號：ER1265、ER0728)購自菲恩生物科技(武漢)有限公司；骨鈣素(osteocalcin，OCN)ELISA試劑盒(貨號：CD-108923)購自純度生物(武漢)科技有限公司、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)(貨號：OX02564)購自上海圻明生物科技有限公司；大鼠I型膠原交聯(lián)C-端肽β序列(β-CTX)ELISA檢測試劑盒(貨號：D731186)購自生工生物工程股份(上海)有限公司；鈣含量檢測試劑盒(貨號：S1063S)購自碧云天(上海)生物公司；酶標儀、轉(zhuǎn)印記系統(tǒng)(型號：PR4100、1703853)購自美國BioRad公司；小動物顯微斷層掃描儀(型號：micro vivaCT 40)購自瑞士Scanco Medical公司。

1.3 方法

1.3.1大鼠分組及模型制備：在本院動物房常規(guī)飼養(yǎng)讓大鼠適應7 d，禁食不禁水12 h后，參文獻稍加改良制備OVX大鼠模型[9-10]：采用2.0%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，以俯臥位將SD大鼠在手術(shù)臺上固定好，在背部腰椎旁肋下一指處作縱向切口，進入腹腔，于子宮角與卵巢相接處結(jié)扎，小心剪取出卵巢，假手術(shù)(Sham)組剪除卵巢附近同樣大小脂肪。之后均逐層縫合皮膚，每日在傷處灑涂青霉粉并肌注抗生素消毒，共3 d。手術(shù)5 d后，行陰道脫落細胞涂片，模型大鼠僅可見黏液及白細胞則為去勢完全。正常飼養(yǎng)12周后檢測骨密度，顯著低于假手術(shù)組則OVX骨質(zhì)疏松模型制備成功。共計30只進入后續(xù)實驗，隨機數(shù)字表法分為：OVX組(生理鹽水)、ACEI組[6 mg/(kg·d)卡托普利]、陽性對照組[0.05 mg/(kg·d)己烯雌酚]，每組10只。根據(jù)卡托普利、己烯雌酚人口服劑量按照體表面積法計算和預實驗確定給藥劑量，灌胃容積10 mL/(kg·d)，另設置假手術(shù)(Sham)組10只，給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥8周。

1.3.2全自動生化分析儀檢測血清Ca、PINP、ALP、OCN、TRAP及β-CTX水平：末次給藥12 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉處死大鼠，立即下腔靜脈取血，分離血清，-80 ℃保存。取各組血清與各試劑盒試劑混勻后，放入全自動生化分析儀，測定并記錄血清Ca、PINP、ALP、OCN、TRAP及β-CTX水平。分離留取腰椎-2(LV-2)、LV5和雙側(cè)脛骨，于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3微型計算機斷層攝影術(shù)(micro-computed tomography，micro CT)法檢測骨密度及微結(jié)構(gòu)：使用小動物micro CT 40儀對1.3.2中LV-2、LV-5進行掃描并采集圖像，獲得三維圖像和定量參數(shù)：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，TB.N)及厚度(trabecular thickness，TB.TH)、骨體積分數(shù)(bone volume over total volume，BV/TV)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure mode index，SMI)、骨小梁分離度(trabecular separation，TB.SP)。

1.3.4TRAP法觀察破骨細胞：將1.3.2中雙側(cè)脛骨在0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)溶液中脫鈣，取出左側(cè)脛骨常規(guī)石蠟包埋，在距骨髓腔生長板1～4 mm處切片(3 μm/片)后行TRAP染色，置于光學顯微鏡下計數(shù)破骨細胞平均數(shù)量。

1.3.5Western blot法檢測骨組織中BMP2、Runx2、KLK、B1R及BK蛋白表達：提取1.3.4中大鼠右側(cè)脛骨近端蛋白質(zhì)。BCA法測定各組蛋白濃度后，分別取15 μg上樣，依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印記、緩沖液洗膜、5%牛奶封閉后，加入BMP2、Runx2、KLK、B1R及BK一抗孵育過夜(4 ℃)，洗膜后加入二抗孵育60 min(室溫)，以增強化學發(fā)光液顯影，在TANON成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 ACEI對OVX大鼠骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的影響

相較于Sham組，OVX組大鼠骨密度、骨小梁數(shù)量及厚度、骨體積分數(shù)、SMI均降低，骨小梁分離度增加(P<0.05)；相較于OVX組，ACEI組、陽性組大鼠骨密度、骨小梁數(shù)量及厚度、骨體積分數(shù)、SMI均增加，骨小梁分離度降低(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 大鼠腰椎micro CT三維圖A：Sham組，B：OVX組，C：ACEI組，D：陽性對照組Fig.1 Micro CT 3D image of rat lumbar spineA: Sham group, B: OVX group, C: ACEI group, D: Positive control group

表1 4組大鼠骨密度和骨微結(jié)構(gòu)比較Table 1 Comparison of bone mineral density and bone microstructure among rats in 4 groups

2.2 ACEI對OVX大鼠血清骨相關(guān)因子的影響

相較于Sham組，OVX組大鼠PINP、ALP、OCN水平降低，TRAP、β-CTX水平增加(P<0.05)；相較于OVX組，ACEI組、陽性組大鼠血清PINP、ALP、OCN水平增加，TRAP、β-CTX水平降低(P<0.05)。4組血清Ca水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 4組大鼠血清骨相關(guān)因子水平比較Table 2 Comparison of serum bone-related factors among rats in 4 groups

2.3 ACEI對OVX大鼠骨組織破骨細胞的影響

OVX組大鼠骨組織中破骨細胞數(shù)量明顯多于Sham組(8.40±0.55 vs 1.80±0.05，P<0.05)；ACEI組、陽性組大鼠骨組織中破骨細胞數(shù)量分別為3.40±4.25、3.20±2.05，均明顯少于OVX組(P<0.05)。見圖2。

圖2 大鼠脛骨近端TRAP染色圖(×400) (紅色所指為破骨細胞)A：Sham組，B：OVX組，C：ACEI組，D：陽性對照組Fig.2 TRAP staining image of the proximal tibia of rats (×400, the red points indicate osteoclasts)A: Sham group, B: OVX group, C: ACEI group, D: Positive control group

2.4 ACEI對OVX大鼠骨組織BMP2、Runx2蛋白表達的影響

相較于Sham組，OVX組大鼠骨組織BMP2、Runx2蛋白表達降低(P<0.05)；相較于OVX組，ACEI組、陽性組大鼠骨組織BMP2、Runx2蛋白表達增高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 大鼠骨組織BMP2、Runx2蛋白印記圖Fig.3 Western blotting map for BMP2 and Runx2 protein in the bone

表3 4組大鼠骨組織BMP2、Runx2蛋白表達比較Table 3 Comparison of protein expression of BMP2 and Runx2 among rats in 4 groups

2.5 ACEI對OVX大鼠骨組織KLK、B1R及BK蛋白水平的影響

相較于Sham組，OVX組大鼠骨組織KLK、B1R及BK蛋白水平增加(P<0.05)；相較于OVX組，ACEI組、陽性組大鼠骨組織KLK、B1R及BK蛋白水平降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 大鼠骨組織KLK、B1R及BK蛋白印記圖Fig.4 Western blotting map for KLK, B1R, and BK protein in the bone

表4 4組大鼠骨組織KLK、B1R及BK蛋白水平比較Table 4 Comparison of protein expression of KLK, B1R, and BK among rats in 4 groups

3 討論

骨質(zhì)疏松除可造成骨流失、骨密度降低外，還可引起骨組織結(jié)構(gòu)尤其是骨小梁病理性疏松[11-12]。OVX動物為較公認的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，能模擬人絕經(jīng)后雌激素減少所致骨質(zhì)疏松癥發(fā)展過程，且成功率高。本研究中構(gòu)建的OVX大鼠骨量減少，密度降低，骨微結(jié)構(gòu)病變，提示成功復制OVX骨質(zhì)疏松大鼠模型。

研究發(fā)現(xiàn)，用于治療心血管疾病的藥物可調(diào)節(jié)骨骼健康，其中一代ACEI類藥物卡托普利作為抗高血壓藥物被發(fā)現(xiàn)可有效抑制去睪丸小鼠骨密度，保護骨小梁[13]。Alaam等[14]研究顯示，ACEI卡托普利可減少雌激素缺乏骨質(zhì)疏松大鼠骨流失，改善骨小梁等微結(jié)構(gòu)。機體內(nèi)骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡是維持正常骨質(zhì)量的前提，激素失調(diào)等可破壞二者間的平衡，導致骨吸收超出骨形成，引起疏松[15]。血清中的ALP、PINP、OCN可反映骨形成水平，TRAP、β-CTX則可反映骨吸收水平，其中PINP和β-CTX為國際推薦的可反映骨轉(zhuǎn)換情況的敏感指標[16]。本研究證明ACEI治療可明顯降低OVX骨質(zhì)疏松大鼠骨吸收，促進骨形成，增加骨量和骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，與雌激素效果一致。另外，ACEI對OVX大鼠的血壓無明顯影響，推測ACEI對血壓正常大鼠的血壓無明顯作用，對OVX大鼠的骨保護作用與血壓無關(guān)。

激肽釋放酶-激肽(kallikrein-kinin system，KKS)系統(tǒng)主要包括KLK、BK、BR等成分，參與各種病理生理過程。一般情況下，B1R低表達，BK水平亦較低，主要與B2R作用發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓、減輕組織損傷等作用，然而應激條件下，B1R上調(diào)表達，同時機體產(chǎn)生大量BK，二者相互作用加重病理損傷[17]。BK可降低成骨細胞分化，增加破骨細胞形成，從而增強骨吸收作用[18]。本研究中，OVX組大鼠破骨細胞數(shù)量增多，成骨細胞活性蛋白表達降低，KLK、B1R及BK蛋白水平增高，表明OVX大鼠的KKS系統(tǒng)處于活化，可能與破骨細胞、成骨細胞活性有關(guān)。ACEI作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)抑制劑一員，過往研究主要集中在其可通過RAS系統(tǒng)發(fā)揮對高血壓等的改善作用，同時對于骨質(zhì)的改善作用也集中在該系統(tǒng)[7，19]?？ㄍ衅绽赏ㄟ^抑制KKS系統(tǒng)，調(diào)節(jié)去睪丸小鼠骨代謝，改善其骨質(zhì)疏松程度[11]。與此類似，本研究也發(fā)現(xiàn)ACEI可抑制OVX大鼠骨組織中KKS系統(tǒng)，抑制破骨細胞活性，增強成骨細胞活性，進而改善骨質(zhì)疏松癥狀。近年研究指出，腎素抑制劑Aliskiren亦可調(diào)節(jié)KKS系統(tǒng)，進而增加骨體積和密度，保護骨小梁的結(jié)構(gòu)和功能[20]。

綜上所述，ACEI可抑制KKS系統(tǒng)，降低破骨細胞活性減少骨吸收，增強成骨細胞活性增加骨形成，提高骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，進而改善OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。然而ACEI對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的改善作用還可能涉及其他機制，且KKS系統(tǒng)在其中的作用值得進一步探究。