李紹爍 陳柏行 陳浩 尹恒 王建偉*

1.無錫市中醫(yī)醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214071

2.比利時魯汶大學骨發(fā)育與再生實驗室，比利時，3000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的全身性、代謝性骨骼疾病，其主要特點是骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量下降、骨質(zhì)脆性增加，導致骨折風險增加[1]。流行病學研究顯示，我國OP患者已逾7 000萬，預計到2050年因骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折耗費的財政支出將達約250億元[2-3]，骨質(zhì)疏松癥已成為我國重點攻關(guān)研究的老年疾病之一[4]。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸道疾病，是常見的消化系統(tǒng)疑難病，目前UC的發(fā)病機制尚不明確，可能與遺傳、免疫、精神心理等因素相關(guān)，據(jù)推測UC在中國的發(fā)病率約為11.6/10萬人[5]。

雖然骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎是兩個不同系統(tǒng)的疾病，但人體是一個復雜而統(tǒng)一的整體，臨床證據(jù)表明，OP與UC之間存在重要的聯(lián)系。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病基礎(chǔ)是成骨細胞-破骨細胞調(diào)控的骨穩(wěn)態(tài)平衡被打破，成骨細胞調(diào)控的骨形成減弱，破骨細胞調(diào)控的骨吸收增強。機體炎癥因子異常表達與骨穩(wěn)態(tài)平衡密切相關(guān)，研究表明UC患者血清腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)等炎癥因子水平明顯高于健康人群，而骨密度則明顯低于健康人群[6]，同時，UC病理過程中小腸對維生素D、維生素K、鈣質(zhì)吸收下降，治療過程中使用糖皮質(zhì)激素，都可能導致OP的發(fā)生或加重[7-8]，而OP發(fā)病過程中骨代謝紊亂相關(guān)的炎癥因子異常表達、免疫功能失調(diào)可能加重UC的病程。

MicroRNA(miRNA)是一類由長度為20～24個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，miRNA通過與信使RNA(mRNA)3′非翻譯區(qū)(UTR)中的互補序列靶向結(jié)合，阻斷蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達，發(fā)揮對基因表達的調(diào)控作用[9-11]。研究表明，miRNA在調(diào)控骨質(zhì)疏松癥及潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸、治療中扮演著重要的角色。Li等[12]發(fā)現(xiàn)miR-188是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化與成脂分化的關(guān)鍵位點，可能是老年骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點；Suarjana等[13]通過對比絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女與絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松癥婦女的血清樣本，發(fā)現(xiàn)miR-21在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組明顯高表達，同時miR-21與骨保護素(OPG)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的表達密切相關(guān)，認為miR-21激活了破骨細胞的增殖分化活動；Cai等[14]對UC患者進行了miRNA芯片測序，發(fā)現(xiàn)UC患者的miR-141可能通過下調(diào)趨化因子5(CXCL5)的表達，激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)信號通路，導致UC的發(fā)病。隨著現(xiàn)代生物信息技術(shù)的高速發(fā)展，人類逐漸深入從微觀分子層面認識疾病的發(fā)生發(fā)展及不同疾病之間的聯(lián)系，但目前從“共病”角度探索骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎的聯(lián)系的研究仍較少。本研究借助現(xiàn)代生物信息學理論方法，通過對比OP與UC的miRNA測序芯片數(shù)據(jù)，挖掘聯(lián)系OP與UC兩個不同疾病的miRNA，嘗試從分子機制層面闡釋OP與UC之間的共病機制，以期為后續(xù)研究提供思路方向。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從美國國立生物信息技術(shù)中心NCBI的基因表達數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)[15]檢索下載骨質(zhì)疏松癥患者miRNA數(shù)據(jù)芯片GSE93883與潰瘍性結(jié)腸炎患者miRNA數(shù)據(jù)芯片GSE63806的原始數(shù)據(jù)。GSE93883芯片包含12例骨質(zhì)疏松癥患者與6名健康對照個體的miRNA表達數(shù)據(jù)，GSE63806芯片包含9例潰瘍性結(jié)腸炎患者與12名健康對照個體的miRNA表達數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達miRNA篩選

GEO數(shù)據(jù)庫在線分析工具GEO2R集成基于R語言的基因表達量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析功能，可對疾病組與對照組數(shù)據(jù)進行組間t檢驗統(tǒng)計分析，篩選差異表達基因[16]。本研究使用GEO2R分別對骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎miRNA芯片數(shù)據(jù)進行差異表達分析，設(shè)置檢驗統(tǒng)計P<0.05、差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)的對數(shù)絕對值|logFC|>1為篩選條件，分別篩選出OP與UC的差異表達miRNA(differentially expressed miRNAs，DEmiRNAs)，并對DEmiRNAs取交集，獲得聯(lián)系OP與UC兩個疾病的關(guān)鍵miRNA。

1.3 DEmiRNA靶標基因預測

使用在線miRNA靶標基因預測工具miRWalk2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2)[17-18]進行OP與UC的共病DEmiRNAs的靶標基因預測。miRWalk集成了包括miRanda[19]、RNA22[20]、miRDB[21]、Targetscan[22]等多個不同的miRNA靶基因預測工具在內(nèi)，可進行多重數(shù)據(jù)庫的miRNA共篩選，并找到其中共有的靶標基因，最大限度增加預測置信度。上傳DEmiRNAs至miRWalk2.0數(shù)據(jù)庫，勾選miRWalk、miRanda、RNA22、miRDB、Targetscan等5個數(shù)據(jù)庫進行DEmiRNAs的靶標基因預測功能，下載保存預測結(jié)果，篩選出5個數(shù)據(jù)庫共有的靶標基因。

1.4 靶標基因蛋白互作分析

人體生物學功能由復雜的基因表達調(diào)控共同完成，基因與基因、非編碼RNA與基因之間存在蛋白產(chǎn)物互作聯(lián)系(protein-protein interaction，PPI)，是基因間互相作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究使用在線蛋白互作分析工具STRING V11(https://string-db.org/)[23]進行OP與UC共病miRNA的靶標基因蛋白互作分析，限定物種為“Homo sapiens”(人類)，關(guān)聯(lián)置信度為<0.40，運行分析，并將結(jié)果導入至生物信息學網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析工具Cytoscape 3.6.1軟件[24-25]進行miRNA靶標基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析。

1.5 靶標基因生物信息學富集分析

基因本體論(gene ontology，GO)通過對基因產(chǎn)物及功能進行注釋分析了解基因潛在生物學功能[26]，京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)從分子信號通路水平對基因參與的生物學功能調(diào)控作用進行分析[27]，兩者為目前最常見的生物信息學分析方法。本研究使用在線基因生物信息學富集分析數(shù)據(jù)庫KOBAS3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)[28]進行靶標基因的GO與KEGG富集分析，設(shè)置檢驗統(tǒng)計P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 共病miRNAs鑒定

使用GEO2R對骨質(zhì)疏松癥miRNA芯片GSE93883與潰瘍性結(jié)腸炎miRNA芯片GSE63806進行差異表達分析，從GSE93883芯片共篩選獲得424個DEmiRNAs，從GSE63806共篩選獲得11個DEmiRNAs，對兩個芯片的DEmiRNAs取交集，最終獲得1個骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎的共病miRNA，為hsa-miR-455-3p。hsa-miR-455-3p在OP與UC芯片的表達情況見表1，取交集情況以韋恩圖(Venn diagram)呈現(xiàn)，見圖1A。

表1 miRNA表達情況Table 1 Expression of miRNA

2.2 miRNA-靶標基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

研究使用miRWalk2.0集成的多個miRNA靶標基因預測數(shù)據(jù)庫對hsa-miR-455-3p進行靶標基因預測與收集。從miRDB預測獲得hsa-miR-455-3p靶向于188個基因，miRanda預測獲得hsa-miR-455-3p靶標基因2 057個，Targetscan預測靶標基因3 090個，RNA22預測得靶標基因3 445個，miRWalk預測靶標基因3 142個，將上述5個數(shù)據(jù)庫獲得的靶基因取共交集，最終獲得hsa-miR-455-3p的靶標基因26個，取共交集情況見圖1B。

圖1 韋恩圖A：OP芯片GSE93883與UC芯片GSE63806取交集；B：miRWalk、miRDB、miRanda、RNA22、Targetscan預測hsa-miR-455-3p靶標基因共交集Fig.1 Venn diagramA: The OP chip gse93883 intersects with UC chip gse63806; B: miRWalk, miRDB, miRanda, RNA22, and Targetscan predict the co-intersection of hsa-mir-455-3p target genes

將獲得的骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎共病miRNA(hsa-miR-455-3p)及其預測的26個靶標基因共同導入至Cytoscape軟件，根據(jù)其靶向關(guān)系構(gòu)建miRNA-靶標基因調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，將miRNA-靶標基因網(wǎng)絡(luò)與miRWalk篩選靶標基因結(jié)果共同輸出，見圖2。

圖2 靶標基因預測與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Potential targets prediction and miRNA-targets network

2.3 靶標基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將獲得的hsa-miR-455-3p靶標基因上傳至STRING V11數(shù)據(jù)庫，運行靶標基因蛋白互作分析，將分析結(jié)果下載導入至Cytoscape軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，靶標基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖3 A，節(jié)點(node)分別代表hsa-miR-455-3p的靶標基因，不同節(jié)點之間以邊線(edge)相連代表其互作關(guān)系。進一步使用Cytoscape軟件的網(wǎng)絡(luò)分析工具MCODE對網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)情況進行分析，MCODE共識別出靶標基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中存在3個子網(wǎng)絡(luò)，子網(wǎng)絡(luò)1(11個節(jié)點，55條邊線)、子網(wǎng)絡(luò)2(7個節(jié)點，18條邊線)、子網(wǎng)絡(luò)3(4個節(jié)點，5條邊線)，子網(wǎng)絡(luò)見圖3B、3C、3D。

圖3 靶標基因互作網(wǎng)絡(luò)A：靶標基因互作網(wǎng)絡(luò)；B：子網(wǎng)絡(luò)1；C：子網(wǎng)絡(luò)2；D：子網(wǎng)絡(luò)3Fig.3 Protein-protein interaction networkA: Target gene interaction network; B: Sub network 1; C: Sub network 2; D: Sub network 3

2.4 靶標基因GO與KEGG富集分析

將篩選獲得的hsa-miR-455-3p靶標基因整理上傳至KOBAS3.0數(shù)據(jù)庫，選定物種為“Homo sapiens”(人類)，分析項目為Gene Oncology、KEGG Pathway，運行富集分析并以檢驗統(tǒng)計P<0.05篩選具有統(tǒng)計學差異的結(jié)果。結(jié)果顯示，26個靶標基因主要顯著富集于8個GO生物學注釋過程，18個KEGG信號通路，將GO與KEGG富集分析結(jié)果整理匯總，見表2、3及圖4。

表2 GO富集分析結(jié)果Table 2 Results of GO enrichment

表3 KEGG信號通路富集分析結(jié)果Table 3 Results of KEGG pathways enrichment

圖4 GO與KEGG富集分析結(jié)果A：GO富集分析結(jié)果，顏色越深代表富集程度越高，氣泡大小代表富集基因數(shù)目；B：KEGG信號通路富集分析結(jié)果，顏色越深代表富集程度越高，氣泡大小代表富集基因數(shù)目Fig.4 Results of GO enrichment and KEGG pathways enrichmentA: The deeper the color, the higher the enrichment degree, the bubble size, and the number of enrichment genes; B: The results of KEGG signal pathway enrichment analysis showed that the darker the color, the higher the enrichment degree, the bubble size, and the number of enriched genes

3 討論

探索骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展背后的分子機制將有助于疾病后續(xù)的診斷、治療及預后?；蛐酒雀咄繙y序技術(shù)的飛速發(fā)展，為我們從微觀分子水平認知疾病提供了機會，更為尋找疾病新的治療靶點提供了客觀基礎(chǔ)。研究表明，miRNA參與調(diào)控約占人體60%的基因組轉(zhuǎn)錄翻譯，廣泛參與目前認知的細胞生物學過程的調(diào)節(jié)，其表達水平與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[29]。本研究立足于對骨質(zhì)疏松癥與潰瘍性結(jié)腸炎臨床證據(jù)的聯(lián)系，運用現(xiàn)代生物信息學技術(shù)方法，對GEO數(shù)據(jù)庫中收錄的OP和UC的miRNA測序芯片數(shù)據(jù)進行挖掘分析，獲得OP與UC的共病聯(lián)系DEmiRNA，并借助在線預測工具獲得miRNA調(diào)控的靶標基因，對靶標基因進行下游相關(guān)的生物學過程、信號通路、基因蛋白互作等分析，探索OP與UC之間潛在的分子機制聯(lián)系。

借助對OP基因芯片GSE93883與UC基因芯片GSE63806進行差異分析及交集映射，獲得了聯(lián)系兩疾病的共病DEmiRNA——hsa-miR-455-3p，目前探索has-miR-455-3p在人體生命活動中所起的功能作用展開的研究已有不少。研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-455-3p在骨代謝活動、炎癥反應(yīng)、細胞周期調(diào)控中扮演重要角色，Zhang等[30]使用枸櫞酸鐵銨(FAC)干預成骨細胞造成細胞內(nèi)鐵過載，建立骨質(zhì)疏松癥模型，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-455-3p可以通過下調(diào)HDAC2蛋白表達，調(diào)控Nrf2/ARE信號通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進成骨細胞增殖；Zeng等[31]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-455-3p可抑制TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵基因ZEB1，調(diào)控TGF-β/Smad信號通路，維持細胞分化活動；Hu等[32]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-455-3p可靶向于TGF-β/Smad信號通路的PAK2基因，抑制軟骨退變；Zhu等[33]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-455-3p調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路抑制高糖誘導的系膜細胞炎癥反應(yīng)；Fiorillo等[34]通過體內(nèi)及體外實驗驗證，證明hsa-miR-455-3p參與調(diào)控NF-κB信號通路，發(fā)揮類似于糖皮質(zhì)激素的抑制慢性炎癥的作用。

miRNA廣泛參與人類、動植物基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以此參與細胞增殖、分化、凋亡等復雜生命活動進程，在這個過程中，miRNA與其靶標基因的結(jié)合是發(fā)揮其調(diào)控作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中通過使用miRWalk、miRDB、RNA22、miRanda、Targetscan等5個miRNA靶標基因預測數(shù)據(jù)庫，獲取了hsa-miR-455-3p的26個靶標基因，并構(gòu)建了miRNA-靶標基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進一步分析發(fā)現(xiàn)靶標基因間存在復雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的蛋白互作關(guān)系。hsa-miR-455-3p的多個靶標基因目前已被證實通過多種信號通路活動參與OP與UC的病理活動。靶標基因p21活化蛋白激酶2(PAK2)被認為是咖啡因代謝導致的骨丟失中的重要靶點，Lu等[35]通過建立咖啡因誘導成骨細胞凋亡的實驗，觀察發(fā)現(xiàn)PAk2是其中的中介位點，咖啡因代謝激活PAK2促進成骨細胞凋亡；TGF-β/Smad信號通路是經(jīng)典的骨代謝調(diào)控通路，靶標基因Smad2在轉(zhuǎn)導細胞膜表面受體的TGF-β信號進入胞核中發(fā)揮重要作用，Qiu等[36]觀察發(fā)現(xiàn)miRNA-214可調(diào)控TGF-β/Smad2促進骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化，抑制成骨分化活動；靶標基因XDH編碼黃嘌呤脫氫酶，黃嘌呤脫氫酶是參與氧化代謝的重要羥化酶成員，一項關(guān)于炎癥性腸病的基因篩查研究發(fā)現(xiàn)，XDH基因多態(tài)性變化影響了UC患者對免疫抑制治療的敏感性[37]。

同時，GO、KEGG富集分析結(jié)果顯示，hsa-miR-455-3p的靶標基因主要富集于細胞代謝活動、細胞周期、咖啡因代謝等生物學過程及信號通路。細胞進程(cellular process)、細胞成分組成(cellular component organization)主要指微觀細胞層面的結(jié)構(gòu)特點，含堿基化合物代謝過程正向調(diào)控(positive regulation of nucleobase-containing compound metabolic process)、離子跨膜運輸(anion transmembrane transport)等主要指細胞的功能活動，均為細胞基礎(chǔ)生命活動形式，hsa-miR-455-3p可能通過調(diào)控靶標基因在上述細胞基礎(chǔ)活動中的表達，影響疾病的病理機制。叉行頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO信號通路是控制細胞凋亡的重要通路，其上游受到PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路等多重調(diào)控，PI3K/AKT信號通路的激活可上調(diào)成骨細胞ALP、BMP2等表達，促進成骨細胞增殖分化，同時還可抑制局部炎癥活動[38-39]；嘌呤代謝、咖啡因代謝等活動與骨代謝及骨細胞增殖分化密切相關(guān)，嘌呤、咖啡因等物質(zhì)也與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子聚集反應(yīng)直接相關(guān)，高尿酸、高咖啡因攝入被認為是骨質(zhì)疏松癥的危險因素[40]。

本研究中篩選獲得的OP與UC共病miRNA(hsa-miR-455-3p)在骨質(zhì)疏松癥患者中表達下調(diào)，但在潰瘍性結(jié)腸炎患者中表達上調(diào)，呈現(xiàn)相反的表達趨勢，hsa-miR-455-3p的靶標基因在調(diào)控OP與UC相關(guān)的骨代謝、炎癥反應(yīng)、細胞周期等過程中亦表現(xiàn)出或相同或不同的趨勢，提示OP與UC之間存在深層次復雜聯(lián)系，并非簡單的正相關(guān)或負相關(guān)調(diào)控關(guān)系。OP與UC均為病理機制尚不完全明確的復雜疾病，與代謝活動、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控等多重因素密切相關(guān)，本研究以miRNA為聯(lián)系OP與UC的切入點，通過挖掘OP與UC患者的miRNA基因芯片，篩選出對OP與UC存在共調(diào)控作用的差異miRNA，發(fā)現(xiàn)該miRNA調(diào)控的靶標基因主要通過參與成骨細胞增殖分化活動、細胞轉(zhuǎn)運活動、嘌呤及咖啡因代謝等環(huán)節(jié)影響OP與UC的疾病發(fā)生發(fā)展進程，認為hsa-miR-455-3p可能是聯(lián)系OP與UC的關(guān)鍵點，是治療OP與UC的潛在治療靶點。另一方面，本研究僅從個別OP與UC的基因芯片數(shù)據(jù)中篩選獲得聯(lián)系兩疾病的miRNA，缺少更大數(shù)據(jù)樣本量的研究支持。目前關(guān)于miRNA的研究仍處于起步階段，存在許多未知的miRNA及其未知的功能等待人類挖掘發(fā)現(xiàn)，希望今后能繼續(xù)深入探索miRNA在不同疾病間的聯(lián)系，幫助從整體對不同疾病病理機制深入理解，服務(wù)于臨床。