龐芳芹，張靖怡，柳 倩，湯欣欣，胡孝明，朱華國

（黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院/經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000）

油茶是山茶屬（Camellia）植物中種子含油率較高樹種的統(tǒng)稱，也是中國特有的木本油料樹，油茶與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料作物［1］。茶油的不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菜油、花生油和豆油，維生素E含量比橄欖油高一倍，并含有山茶甙等特定生理活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值［2］。同時(shí)，油茶林是良好的生態(tài)林，油茶也是農(nóng)林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、精準(zhǔn)扶貧的重要經(jīng)濟(jì)作物，發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)具有很高的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益［3］。

1979年，中國第一次開展油茶組織培養(yǎng)試驗(yàn)，顏慕勤等［4］通過試管對(duì)下胚軸進(jìn)行培養(yǎng)，獲得第一批完整植株。而后，顏慕勤［5］以人工誘導(dǎo)油茶體細(xì)胞胚狀體試驗(yàn)獲得成功，并對(duì)油茶體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生進(jìn)行了連續(xù)切片觀察，發(fā)現(xiàn)油茶體細(xì)胞胚狀體是從子葉基部分化而來。隆振雄［6］和盧天玲［7］先后分別利用油茶未成熟子葉幼胚離體培養(yǎng)獲得再生植株。李建安等［8］對(duì)紅花油茶的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，并誘導(dǎo)形成愈傷組織。畢方鋮等［9］對(duì)油茶的莖段、幼胚、子葉在離體條件下進(jìn)行誘導(dǎo)獲得再生植株。截止目前，油茶組織培養(yǎng)方面取得了較多進(jìn)展［10-13］，但尚未建立以體細(xì)胞胚胎發(fā)生為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，可能與油茶以體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式獲得植株再生效率低有關(guān)。

中國食用油消費(fèi)量巨大，但目前自給率不足40%，嚴(yán)重影響了中國的糧油安全［14］。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，開發(fā)山地空間，不僅不會(huì)出現(xiàn)與糧食爭(zhēng)地的問題，還能提高國土資源使用效率，使國家糧油安全得到保障［15］。湖北省麻城市位于大別山區(qū)中段南麓，油茶種植歷史悠久，資源豐富［16，17］。隨著生產(chǎn)發(fā)展和社會(huì)需求的不斷提高，生產(chǎn)上對(duì)油茶品種的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等提出越來越高的要求，這些問題的解決僅依靠傳統(tǒng)育種手段已無法滿足［18，19］。建立以體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式獲得再生植株的技術(shù)體系，可為建立油茶以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年7月中旬，取自湖北省麻城市（東經(jīng)114°40′—115°28′，北緯30°52′—31°36′）成熟油茶林優(yōu)良單株上性狀良好、無病蟲害的油茶果實(shí)，并做好標(biāo)記。茶果置于4℃冰箱保存，3 d內(nèi)完成消毒接種。

1.2 方法

徒手剝?nèi)ビ筒韫麑?shí)果皮，放在75%乙醇表面消毒2 min，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4次，剝掉內(nèi)種皮。在無菌條件下將幼胚切塊，每個(gè)幼胚切成3～5塊，接種于90 mm培養(yǎng)皿中，每皿接種7～9個(gè)外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置兩種組合，均以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別附加2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）+1.0 mg/L KT和5.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，pH調(diào)至5.8，用于愈傷組織誘導(dǎo)。1個(gè)月后，2種處理的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為83.23%和45.35%，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織繼代至分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基附加1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，pH調(diào)至5.8）進(jìn)行分化調(diào)控。繼代2次后，胚狀體平均發(fā)生率為15.25%。將出現(xiàn)胚狀體的外植體轉(zhuǎn)入胚狀體發(fā)育培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA，pH調(diào)至5.8）中繼續(xù)培養(yǎng)。直至獲得具有明顯子葉的胚狀體后，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基（1/2 MS+3.0 mg/L 6-BA，pH調(diào)至5.8）培養(yǎng)。獲得具備根和芽的完整植株后，馴化并轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)缽內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)。以上每處理18皿，重復(fù)3次，均在28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照16 h/d，光照度為2 500 lx，30 d左右繼代1次。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)/接種外植體數(shù)×100%，胚狀體發(fā)生率=胚狀體數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

取7月中旬未成熟幼胚，消毒后每個(gè)幼胚用手術(shù)刀切成3～5塊，接種于2種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)（圖1A）。1個(gè)月后，可見外植體邊緣出現(xiàn)明顯的愈傷組織。2，4-D+KT組合誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)疏松、顏色淺而透明的愈傷組織（圖1B、圖1C），而NAA+KT組合則誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)緊密、綠色的愈傷組織（圖1D、圖1E），部分幼胚塊長(zhǎng)出少量愈傷組織的同時(shí)長(zhǎng)出明顯的根狀物（圖1F）。

圖1 油茶的愈傷組織誘導(dǎo)

2.2 愈傷組織的分化與胚狀體形成

選擇結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過2～3個(gè)月的培養(yǎng)，愈傷組織顏色逐漸加深，產(chǎn)生肉眼可見的胚狀體，白色、綠色和淡黃色胚狀體呈簇形成（圖2A、圖2B、圖2C）；部分形成了根狀物的愈傷組織中也有少數(shù)形成了胚狀體（圖2D），表明2種不同的激素組合處理形成胚狀體的方式不同。

圖2 油茶愈傷組織的分化及胚狀體發(fā)生

2.3 胚狀體發(fā)育及植株再生

將胚狀體繼代到胚狀體發(fā)育培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，可見部分胚狀體進(jìn)一步發(fā)育形成了具備完整子葉的個(gè)體（圖3A、圖3B）。將胚狀體進(jìn)行生根培養(yǎng)后，可以形成肉眼可見的根系，經(jīng)過馴化后移栽至營養(yǎng)缽可以進(jìn)一步生長(zhǎng)（圖3C、圖3D）。

圖3 油茶的胚狀體發(fā)育及植株再生

3 討論

以7月中旬麻城油茶幼胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體分化、發(fā)育、生根過程后，可以獲得具備根和芽的完整植株，建立了6個(gè)月內(nèi)獲得麻城油茶通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式獲得再生植株的技術(shù)體系。愈傷組織誘導(dǎo)階段發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基附加2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT激素能夠有效誘導(dǎo)愈傷組織，后期通過更換生長(zhǎng)素類型能較好地促進(jìn)胚狀體的分化和發(fā)育，與其他很多植物組織培養(yǎng)中的過程類似，表明生長(zhǎng)素對(duì)于油茶的體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有較大的影響。此外，在胚狀體分化階段，嘗試過低濃度NAA處理，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度過低時(shí)愈傷組織會(huì)大量死亡，而NAA濃度上升到1.0 mg/L時(shí)，褐化效果得到明顯改善。由于植物組織培養(yǎng)受基因型限制，不同的油茶品種必然出現(xiàn)不一樣的表現(xiàn)，本研究所建立的體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系是否適應(yīng)于其他油茶品種還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。