王曉敏，王楠楠，蘇凱，武桂祥，馬士崟，李慧

下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HSCC)是上消化道粘膜引起的惡性腫瘤,占頭部和頸部所有鱗狀細(xì)胞癌的5%[1]。下咽組織解剖結(jié)構(gòu)特殊,暴露困難,該部位惡性腫瘤發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，且生物學(xué)特性惡劣,易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，故大多患者就診時(shí)往往已是晚期(Ⅲ期和IV期)，常常伴有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故而預(yù)后不良[2]。近年來(lái)，下咽癌的治療模式已由手術(shù)為主的綜合治療轉(zhuǎn)變?yōu)橥椒呕?如腫瘤未控再行挽救性手術(shù))，雖然喉功能的保存率較以前提高，但其生存率并無(wú)明顯改變，5年期存活率僅為25%～40%[3]。因此，在分子水平上開展HSCC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究將有助于提高HSCC的診治水平。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA)肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1， MALAT-1) 屬于核內(nèi)保留RNA，主要通過與細(xì)胞核內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表達(dá)調(diào)控[4]。其在多種正常組織中表達(dá)，而在多種腫瘤中表達(dá)明顯上升，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等[5]。研究[6]表明過表達(dá)MALAT-1通過激活ERK / MAPK、p53、Wnt / β-catenin等信號(hào)通路和細(xì)胞周期等途徑增加細(xì)胞增殖。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，屬于MAPK家族，ERK主要被各種生長(zhǎng)因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活,激活的ERK信號(hào)能夠下調(diào)部分抗增殖或腫瘤抑制基因[7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道MALAT-1在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者高表達(dá)[8]以及在喉癌、下咽癌發(fā)展中的作用[9]，本課題組先前對(duì)MALAT-1在喉鱗狀細(xì)胞Hep-2細(xì)胞的增殖和遷移已有部分基礎(chǔ)研究[10]，但是在下咽癌中尚未有進(jìn)一步研究。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下咽癌組織中MALAT-1高表達(dá)，我們推測(cè)在下咽癌中MALAT-1可能是促癌基因，并可能通過激活ERK / MAPK發(fā)揮重要作用。本研究旨在分析LncRNA MALAT-1及ERK蛋白在下咽癌患者中的表達(dá)及其兩者與臨床病理特征的關(guān)系，為HSCC的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后因素提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取2015年3月—2020年4月通過耳鼻咽喉科頭頸外科就診并接受手術(shù)治療的未經(jīng)放化療藥物治療的HSCC患者35例，選取手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本及同一患者癌旁下咽粘膜組織(距離腫瘤外緣>2 cm)，所有標(biāo)本經(jīng)病理科 2 位專業(yè)技術(shù)人員診斷后確診癌組織為HSCC，癌旁為下咽黏膜正常組織。將下咽鱗狀細(xì)胞癌組織設(shè)為觀察組，將癌旁組織設(shè)為對(duì)照組。隨訪時(shí)間從手術(shù)時(shí)間開始，截止2021年2月或死亡或失訪(電話隨訪)。研究過程符合我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 miRNeasy?Mini kit，miScriptRT kit和miScriptSYBRGreen PCR Kit由德國(guó)Qiagen 公司提供，引物序列由Qiangen公司設(shè)計(jì)合成，EliVisionTMplus試劑盒購(gòu)于邁新生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒及其他試劑購(gòu)于上海碧云天公司，ERK蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。主要儀器有美國(guó)GE公司的NanoVueTM Plus 光度儀,美國(guó)ABI公司的Step One TM Real-Time PCR 儀。

1.3 下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中總RNA的提取 依據(jù)miRNeasy?Mini Kit使用說明書提取細(xì)胞總miRNA,NanoVueTM Plus 光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度,A260/A280 比值需在1.9～2.1。利用miScriptRT Kit逆轉(zhuǎn)錄RNA, 選擇GAPDH作為內(nèi)參, 引物序列如下:MALAT1:F: 5'-AGC GGA ACG AAT GTA ACT-3', R: 5'-TTG CCT ACC ACT CTA AGA TTG T-3'；GAPDH:F: 5'-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3'，R: 5'-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3'。依據(jù)miScript SYBR Green PCR Kit 說明書在ABI Step One TM Real-Time PCR 儀進(jìn)行Q-PCR, 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔, 計(jì)算復(fù)孔的Ct平均值, 按照2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式得到相對(duì)定量結(jié)果。

1.4 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)ERK蛋白表達(dá)水平 下咽鱗狀細(xì)胞癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織的石蠟標(biāo)本按以下步驟處理：經(jīng)過4%中性甲醛溶液固定，切片4 μm，經(jīng)二甲苯溶液脫蠟和梯度濃度的乙醇溶液脫二甲苯至水洗；3 %H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；5～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的ERK一抗或一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37 ℃孵育10～30 min；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃或室溫孵育10～30 min；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37 ℃孵育10～30 min；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃或室溫孵育10～30 min；PBS沖洗，5 min×3次；顯色劑顯色(DAB或AEC)，自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，封片。陽(yáng)性對(duì)照采用已知的陽(yáng)性切片，空白對(duì)照采用同種屬的IgG代替。

1.5 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果參照參考文獻(xiàn)[7]的評(píng)分方法:0級(jí)，無(wú)染色；1級(jí)淺黃色，2級(jí)棕黃色，3級(jí)棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞百分率分級(jí)：0級(jí)，陽(yáng)性細(xì)胞<5%；1級(jí)，5%～25%;2級(jí)，25%～50%；3級(jí)≥50%。組織學(xué)評(píng)分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分率。0～3分為陰性，4～6分為陽(yáng)性，7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MALAT1 在觀察組和對(duì)照組中的表達(dá) 與對(duì)照組癌旁組織比較，下咽癌組織中LncRNA MALAT1的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 觀察組和對(duì)照組中LncRNA MALAT1的表達(dá)水平比較

2.2 觀察組和對(duì)照組中ERK的表達(dá) ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色，主要顯色在細(xì)胞質(zhì)中(圖1)，其在癌組織中的陽(yáng)性率為88.57%，高于癌旁組織的22.86%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

1A 正常喉癌旁組織中ERK陰性表達(dá) 1B 喉癌組織中ERK陽(yáng)性表達(dá)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移圖1 ERK蛋白在癌旁組織和癌組織中的免疫組化染色

表2 觀察組和對(duì)照組中ERK的表達(dá)水平比較

2.3 下咽癌組織中LncRNA MALAT1高表達(dá)與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中LncRNA MALAT1的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、吸煙史和腫瘤直徑均無(wú)關(guān)(P>0.05),而與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 LncRNA MALAT1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 下咽癌組織中ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中ERK蛋白的表達(dá)水平與患者年齡、吸煙史和腫瘤直徑等指標(biāo)無(wú)關(guān)(P>0.05),而與患者的性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等指標(biāo)有關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 ERK表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 下咽癌組織中LncRNA MALAT1高表達(dá)和ERK蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 下咽癌患者術(shù)后1～60個(gè)月，LncRNA MALAT1高表達(dá)及低表達(dá)的5年總生存率分別為22.9%(8/27)和75.00%(6/8)(見圖2)。ERK陽(yáng)性和陰性患者的5年總生存率分別為 38.71%(12/31)和75.00%(3/4)(見圖3)，差異均具有顯著性意義(P<0.05)。

圖2 下咽癌患者組織LncRNA MALAT1表達(dá)生存曲線

圖3 下咽癌患者組織ERK表達(dá)生存曲線

3 討論

下咽鱗狀細(xì)胞癌占所有頭頸部癌癥的3%～5%，60%～85%的下咽癌患者在診斷時(shí)臨床分期達(dá)到III-IV期。因此盡管采用積極的多學(xué)科治療，下咽癌的預(yù)后都比較差。此外臨床陽(yáng)性淋巴結(jié)出現(xiàn)率高，復(fù)發(fā)率高以及第二原發(fā)性腫瘤也可能導(dǎo)致預(yù)后不良[11]。因此，在分子水平上開展HSCC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究將有助于提高HSCC的診治水平。非編碼RNA(ncRNA)是一類新興的轉(zhuǎn)錄物，由基因組編碼，但大部分不翻譯成蛋白質(zhì)。盡管沒有翻譯，ncRNAs在多種細(xì)胞和生理功能中扮演著重要角色。特別是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(長(zhǎng)度大于200 nt的ncRNA)在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)、基因表達(dá)、生長(zhǎng)、分化和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[12]。研究[13]證實(shí)LncRNAs參與HSCC的進(jìn)展，然而關(guān)于LncRNA MALAT1在下咽癌中的作用尚不明確。近年來(lái)人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在多種腫瘤疾病中的生物學(xué)功能作用，有研究[14]表明，在胃癌、肝癌、食管癌等多種腫瘤中LncRNA MALAT1的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，此外，還有研究[15]證實(shí)LncRNA MALAT1過表達(dá)可以促進(jìn)NSCLC中的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞從而促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移瘤的形成。已有的研究[16]結(jié)果表明LncRNA MALAT1在喉癌、鼻咽癌、口腔癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)，因此我們認(rèn)為L(zhǎng)ncRNA MALAT1與下咽癌的進(jìn)展有關(guān)。本研究通過RT-qPCR檢測(cè)觀察組和對(duì)照組中LncRNA MALAT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在下咽癌組織中高表達(dá)，并顯著高于癌旁組織，提示LncRNA MALAT1參與下咽癌的發(fā)生發(fā)展。通過分析臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1與下咽癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等指標(biāo)有關(guān)。進(jìn)一步分析5年生存率發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1高表達(dá)的患者總生存率33.33%明顯低于低表達(dá)患者的75%，本資料結(jié)果提示LncRNA MALAT1高表達(dá)可能具有促進(jìn)癌癥進(jìn)程的作用并影響下咽癌患者的預(yù)后效果。

ERK屬于有絲分裂原蛋白活化激酶(mitogen-activated protein kinase , MAPK)三大家族之一，主要由生長(zhǎng)因子，例如表皮生長(zhǎng)因子，(epidermal growth factor, EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)激活, 調(diào)節(jié)有絲分裂信號(hào)，因此能夠通過磷酸化含有絲氨酸或者蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)基序的特異性底物蛋白來(lái)控制細(xì)胞增殖、生存、分化和遷移。已有研究[17]表明在膠質(zhì)瘤中LncRNA MALAT1通過促進(jìn) P-ERK1/2 的表達(dá)水平，最終激活 ERK/MAPK 信號(hào)通路，發(fā)揮促進(jìn)增膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的功能。為了證實(shí)ERK在下咽癌中的作用，在本研究中，采用IHC檢測(cè)ERK的陽(yáng)性表達(dá)，與對(duì)照組相比ERK在觀察組中表達(dá)水平明顯上調(diào)，ERK在觀察組中的陽(yáng)性表達(dá)水平為88.57%顯著高于對(duì)照組22.86%。通過分析臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，ERK與淋巴結(jié)分期和TNM分期有關(guān)。此外，ERK陽(yáng)性和陰性患者的5年總生存率分別為 38.71%和75.00%，表明ERK的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤組織的增殖、分化，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床預(yù)后較差。ERK表達(dá)量增高表明其可能通過是ERK/MAPK信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[17]。需要指出的是，我們的分析結(jié)果表明，ERK與患者性別也有關(guān)，造成這種結(jié)果的原因可能是本研究樣本中女性患者少，僅有1例，且ERK陽(yáng)性占比高。由于本研究收集樣本的量較少，在下一步研究中，將擴(kuò)大研究的樣本量，同時(shí)對(duì)下咽癌患者進(jìn)行定期隨訪，以進(jìn)一步分析LncRNA MALATl的表達(dá)值在下咽癌患者預(yù)后判斷中的意義。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LncRNA MALAT1和ERK蛋白均在下咽癌患者中表達(dá)顯著上調(diào)，并且其表達(dá)水平與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移指標(biāo)有關(guān)，筆者認(rèn)為L(zhǎng)ncRNA MALATl對(duì)下咽癌早期診斷及療效監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)記物提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其作用與下咽癌的可能性機(jī)制進(jìn)行了初步分析，未來(lái)需要明確LncRNA MALATl在下咽癌中與ERK作用的具體機(jī)制，為下咽癌治療提供依據(jù)。