馮信 張春梅 王宏偉

摘要：【目的】鑒定玉米EXO70s（ZmEXO70s）基因家族成員，分析其遺傳變異與玉米耐熱性的關聯(lián)性，為揭示其在玉米耐熱方面的功能和分子機制打下基礎?！痉椒ā恳詳M南芥EXO70s（AtEXO70s）基因家族成員序列為參考，利用MaizeGDB和NCBI數(shù)據(jù)庫從玉米全基因組中鑒定出ZmEXO70s基因家族成員，對其進行基因結(jié)構及系統(tǒng)進化分析，根據(jù)其在系統(tǒng)發(fā)育進化樹上的位置對其進行系統(tǒng)命名，并基于轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)分析ZmEXO70s基因家族成員在不同組織及非生物脅迫下的表達模式。最后，鑒定玉米自交群體AM368中ZmEXO70s基因SNP位點，結(jié)合玉米AM368群體苗期耐熱存活率進行基因家族關聯(lián)分析?！窘Y(jié)果】從玉米全基因組序列中共鑒定出36個ZmEXO70s基因，分布在10條染色體上，長度為228～3726 bp，編碼75～1241個氨基酸殘基，蛋白分子量為8.6～136.6 kD，理論等電點（pI）介于4.5～9.9，大部分蛋白pI小于7.0。擬南芥、水稻和玉米的EXO70s蛋白被分為9組（A組～I組），其中ZmEXO70s蛋白在各組中均有分布。大多數(shù)ZmEXO70s基因不含內(nèi)含子，只有少數(shù)基因含有內(nèi)含子，且內(nèi)含子數(shù)量不同。36個ZmEXO70s蛋白共含8種基序（Motif 1～Motif 8），主要集中在C端，說明這些蛋白端序列較保守，且Motif 1～Motif 8組成Exo70保守結(jié)構域。ZmEXO70s基因在不同組織中的表達水平均存在明顯差異，其中ZmEXO70B3基因在雄穗、花藥、葉片和花絲中高表達，ZmEXO70C1a基因只在雄穗和花藥中高表達，ZmEXO70D2b基因在胚乳和萌發(fā)種子中低表達，ZmEXO70G1c基因在花絲和萌發(fā)種子中低表達。有23個ZmEXO70s基因至少可響應一種非生物脅迫，說明這些ZmEXO70s基因參與非生物脅迫響應過程。ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因的遺傳變異與玉米苗期耐熱性具有顯著相關性（P≤0.01）?！窘Y(jié)論】ZmEXO70s基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育進化上較保守，其基因組復制事件可能發(fā)生在禾本科植物分化后，且大多數(shù)ZmEXO70s基因被保留，僅部分基因被丟失。ZmEXO70s基因可能在非生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因可作為調(diào)控玉米苗期耐熱性重要候選基因。

關鍵詞： 玉米;EXO70;基因家族鑒定;苗期耐熱性;關聯(lián)性分析;表達分析;胞泌復合體

中圖分類號： S513.035.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-0867-12

Identification of ZmEXO70s gene family in maize and its correlation with heat tolerance at seedling stage

FENG Xin1， ZHANG Chun-mei1， WANG Hong-wei1，2

（1Agricultural College， Yangtze University， Jingzhou， Hubei? 434025， China; 2Hubei Collaborative Innovation

Center for Grain Industry， Yangtze University， Jingzhou， Hubei? 434025， China）

Abstract：【Objective】To identify the members of maize ZXO70s（ZmEXO70s） gene family and analyze the correlation between their genetic variation and maize heat tolerance， and lay the foundation for defining its functional and mole-cular mechanisms in maize heat tolerance. 【Method】With the sequences of Arabidopsis thaliana EXO70s（AtEXO70s） gene family members as reference， the members of the ZmEXO70s gene family were identified from the whole maize genome by MaizeGDB and NCBI databases， and the gene structure and phylogenetic analysis were carried out， and the members were systematically named according to their positions in the phylogenetic tree. Based on transcriptome sequencing （RNA-Seq） data， the expression patterns of ZmEXO70s gene family members under different tissues and abiotic stresses were analyzed. Finally， the SNP loci of ZmEXO70s gene in maize self-crossing population AM368 were identified， and gene family association analysis was conducted in combination with the heat resistance survival rate of maize AM368 at seedling stage. 【Result】A total of 36 ZmEXO70s genes were identified from the whole genome sequence of maize， distri-buted on 10 chromosomes， with lengths ranging from 228 to 3726 bp， encoding 75-1241 amino acids， molecular weight of proteins ranging from 8.6 to 136.6 kD， theoretical isoelectric point（pI） ranging from 4.5 to 9.9， and pI of most proteins was less than 7.0. The EXO70s proteins of A. thaliana， rice and maize were divided into 9 groups（groups A to I）， with ZmEXO70s proteins distributed in each group. Most ZmEXO70s genes did not contain introns， and only a few did， with varying numbers of introns. The 36 ZmEXO70s proteins contained 8 motifs（Motif 1-Motif 8）， which were mainly concentrated in the C terminal， indicating that the ZmEXO70s C terminal sequence was relatively conservative， and Motif 1-Motif 8 constituted the conservative domain of Exo70. The expression level of the ZmEXO70s gene varied greatly in different tissues. The ZmEXO70s gene was highly expressed in panicle and anther， leaf and filaments， ZmEXO70C1a gene was only highly expressed in panicle and anther， and ZmEXO70D2b gene was lowly expressed in endosperm and germinal seed. ZmEXO70G1c gene was lowly expressed in filaments and germinated seeds. Twenty-three ZmEXO70s genes could respond to at least one abiotic stress， suggesting that these ZmEXO70s genes were involved in the abiotic stress response process. The genetic variation of ZmEXO70D2a and ZmEXO70E1 was significantly correlated with maize seedling heat resistance（P≤0.01）. 【Conclusion】The members of the ZmEXO70s gene family are relatively conserved in phylogenetic evolution， and the genome replication event may occur after the differentiation of Gramineae， and most of the ZmEXO70s genes are retained， while some of them are lost. ZmEXO70s may play an important role in abiotic stress response， ZmEXO70D2a and ZmEXO70E1 genes may be important candidate genes for the regulation of maize seedling heat tolerance.

Key words： maize; EXO70; gene family identification; heat resistance at seedling stage; correlation analysis; expression analysis;? secretion complex

Foundation item： General Project of Hubei Natural Science Foundation（2019CFB616）

0 引言

【研究意義】胞吐是細胞中一類重要的囊泡運輸，由高爾基體運輸囊泡與細胞質(zhì)膜融合，介導胞內(nèi)物質(zhì)分泌到細胞外及膜蛋白向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運過程（Zhang et al.，2010a;Heider and Munson，2012）。胞泌復合體負責將高爾基囊泡栓系到細胞質(zhì)膜上（Sekere? et al.，2017;Kulich et al.，2018），是胞吐囊泡栓系過程中發(fā)揮關鍵作用的一類栓系因子，該復合體由8個蛋白亞基構成，其中EXO70是組成胞泌復合體功能的關鍵亞基，其決定胞泌復合體導向靶標膜的胞吐位點，參與細胞壁形成、細胞分泌和抗逆應答等重要細胞學過程（Sekere? et al.，2017;Kulich et al.，2018）。鑒定玉米（Zea mays L.）EXO70s基因（ZmEXO70s）家族成員，分析其進化及表達模式，尤其是探究其遺傳變異與玉米耐熱性的關系，對深入了解玉米響應高溫脅迫的分子機制及發(fā)展玉米耐熱性育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前關于植物胞泌復合體的研究主要集中在EXO70家族，其中在毛果楊（Populus trichocarpa）（Elias et al.，2003）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Chong et al.，2010）、高粱（Sorghum bicolor）（Cvr?ková et al.，2012）、水稻（Oryza sativa）（Tu et al.，2015）、土豆（Symphytum tuberosum）（Du et al.，2018）和小麥（Triticum aestivum）（Zhao et al.，2018）等物種中已分別鑒定出31、23、22、41、29和75個EXO70蛋白，且部分EXO70蛋白的生物學功能已被驗證。如擬南芥EXO70A1（AtEXO70H4）蛋白參與管狀分子分化、組織（種皮、根毛和柱頭乳突）發(fā)育及凱氏帶形成（Kulich et al.，2010;Kalmbach et al.，2017;Vuka?inovi? and ?ársk?，2017），AtEXO70H4蛋白通過調(diào)節(jié)胼胝質(zhì)和二氧化硅的分泌及積累以調(diào)控毛狀體細胞壁的成熟（Chen et al.，2014），AtEXO70C1和AtEXO70C2蛋白可調(diào)控擬南芥花粉管成熟及其極性生長過程（Synek et al.，2017）;水稻EXO70A1（OsEXO70A1）蛋白在維管束分化和礦物質(zhì)營養(yǎng)同化過程中發(fā)揮重要作用（Tu et al.，2015）。此外，已有較多研究證實，EXO70s蛋白在植物與病原體的相互作用及對非生物脅迫的響應過程中發(fā)揮重要作用。如煙草（Nicotiana benthamiana）中2個EXO70B同源基因能沉默增加植株對晚疫病菌的感病性（Du et al.，2018）;AtEXO70B1、AtEXO70B2和AtEXO70H1基因均參與植物免疫反應調(diào)控，其中AtEXO70B1基因缺失導致水楊酸積累，其突變體出現(xiàn)異位過敏反應并對多種病原體產(chǎn)生廣譜抗性（Pe?enková et al.，2011;Kulich et al.，2013）;AtEXO70B1和AtEXO70B2蛋白參與非生物應激反應，二者均為氣孔運動的正向調(diào)節(jié)因子，如在干旱或甘露醇滲透脅迫下，通過依賴或不依賴脫落酸的信號傳導來響應脅迫（Hong et al.，2016;Seo et al.，2016）?？梢?，EXO70s蛋白參與胞吐有關多種重要的生物學過程。【本研究切入點】雖然植物中存在大量的EXO70s基因，但目前僅對少數(shù)物種EXO70s基因進行生物學功能分析，鮮見有關ZmEXO70s基因家族的研究報道。因此，揭示ZmEXO70s基因家族成員數(shù)量、逆境脅迫響應機制及其與苗期耐熱性的相關性，不僅有利于推進玉米耐熱性的遺傳改良，還有助于加深對該基因家族生物學功能的認識。【擬解決的關鍵問題】以AtEXO70s基因家族成員序列為參考，利用MaizeGDB和NCBI數(shù)據(jù)庫從玉米全基因組中鑒定出ZmEXO70s基因家族成員，結(jié)合擬南芥和水稻的EXO70s蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析及系統(tǒng)命名，并基于轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)對ZmEXO70s基因家族成員在不同組織及非生物脅迫下的表達模式進行分析，探析ZmEXO70s基因的遺傳變異與玉米耐熱性的相關性，為揭示該基因家族在玉米生長發(fā)育和非生物脅迫響應中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)，也為玉米耐熱性分子育種提供基因資源。

1 材料與方法

1. 1 ZmEXO70s基因家族成員鑒定

從TAIR數(shù)據(jù)庫中（https：//www.arabidopsis.org/）查找23個AtEXO70s基因及其編碼蛋白的相關信息;在RGAP7數(shù)據(jù)庫中搜索OsEXO70s基因家族編碼的蛋白序列。根據(jù)AtEXO70s和OsEXO70s蛋白序列，在Phytozome數(shù)據(jù)庫中（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）對玉米B73基因組（AGPv3）進行BLASTp序列比對分析，并將獲得的蛋白序列在NCBI的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）進行蛋白結(jié)構預測，篩選出包含結(jié)構域pfam03081的序列，最終確定ZmEXO70s基因家族成員。

1. 2 ZmEXO70s基因結(jié)構及系統(tǒng)發(fā)育進化分析

使用ClustalX 2.0將ZmEXO70s基因編碼區(qū)序列與其對應的參考基因序列進行比對，并使用CSDS 2.0進行基因結(jié)構分析。利用MEME和TBtools分析ZmEXO70s蛋白的保守基序（Motif），以Pfam在線分析ZmEXO70s蛋白的結(jié)構域，運用ClustalX 2.0比對ZmEXO70s、OsEXO70s和AtEXO70s蛋白序列，并以MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，參數(shù)是配對刪除（Pairwise deletion）和1000次置換檢驗（Bootstrap）。

1. 3 ZmEXO70s基因在不同組織及非生物脅迫下的表達分析

利用玉米B73的RNA-Seq數(shù)據(jù)（Sekhon et al.，2011;Li et al.，2017）對ZmEXO70s基因在不同組織及非生物脅迫下的表達情況進行分析。以轉(zhuǎn)錄組分析通用的FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值作為目的基因相對表達量。為方便統(tǒng)計，對每個表達數(shù)值取以2為底數(shù)的對數(shù)（log2）來繪制ZmEXO70s基因的表達熱圖。

1. 4 ZmEXO7基因遺傳變異與玉米苗期耐熱性的關聯(lián)分析

ZmEXO70s耐熱候選基因家族關聯(lián)分析參照Li等（2013）的方法。該定位群體由全球代表性的368個玉米自交系群體（AM368）構成，含有55.6萬高質(zhì)量的SNP分子標記，其微等位基因頻率（MAF）>0.05（Li et al.，2013）。使用TASSEL的2個統(tǒng)計模型（Bradbury et al.，2007），即一般線性模型（GLM）和混合線性模型（MLM）進行SNP分子標記與苗期耐熱性的關聯(lián)分析。其中，GLM是將群體結(jié)構考慮在內(nèi)，結(jié)合基因型數(shù)據(jù)及表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析;MLM則是將群體結(jié)構和親緣關系均考慮在內(nèi)，結(jié)合基因型數(shù)據(jù)及表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析（Zhang et al.，2010b;Li et al.，2013）。

1. 5 AM368群體苗期耐熱存活率表型

在長江大學農(nóng)學院的步入式生長溫室中對AM368群體自交系進行6次苗期耐熱表型鑒定。以玉米苗期高溫存活率為統(tǒng)計指標，試驗設2次重復，采用隨機區(qū)組設計。每個小缽子種植12棵玉米，稱取相同重量的土壤基質(zhì)，嚴格控制土壤基質(zhì)的重量和水分，待幼苗生長至3葉1心期時，對其進行42 ℃高溫脅迫處理。當玉米出現(xiàn)葉片萎蔫及植株死亡表型時溫度降至25 ℃，并在25 ℃恢復7 d后統(tǒng)計各自交系的存活率。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ZmEXO70s基因家族成員鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

根據(jù)氨基酸序列相似性比對及NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTp序列比對等生物信息學分析，共鑒定出36個ZmEXO70s基因家族成員，其GenBank登錄號、染色體位置、基因長度及編碼蛋白的理化性質(zhì)如表1所示。36個ZmEXO70s基因分布在10條染色體上，基因序列長度和氨基酸數(shù)目各不相同，其中ZmEXO70G1a基因序列長度為228～3726 bp，編碼75～1241個氨基酸殘基，蛋白分子量為8.6～136.6 kD，理論等電點（pI）為4.5～9.9，大部分蛋白理論等電點小于7.0。

2. 2 ZmEXO70s蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果

為了探究玉米與其他物種EXO70蛋白的同源進化關系，將已知的23個AtEXO70s蛋白（Chong et al.，2010）、41個OsEXO70s蛋白（Cvr?ková et al.，2012）和本研究鑒定出的36個ZmEXO70s蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，結(jié)果如圖1-A所示。擬南芥、水稻和玉米的EXO70s蛋白可分為9組（A組～I組），各組數(shù)目不相同，以E組數(shù)目最少、I組數(shù)目最多。結(jié)合前人構建的AtEXO70s和OsEXO70s蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Chong et al.，2010;Cvr?ková et al.，2012），對ZmEXO70s基因家族成員進行系統(tǒng)命名。由圖1-B可知，各組蛋白間有較高的同源性，十字花科植物擬南芥的AtEXO70s蛋白在不同組中均聚在同一小分支，OsEXO70s和ZmEXO70s蛋白則聚在其他小分支，究其原因可能是水稻和玉米同為禾本科植物，二者親緣關系較近。由表2可知，ZmEXO70s蛋白在不同組中均有分布，數(shù)目較多的是F組和I組，分別含有8和6個;數(shù)目最少的是E組和H組，分別只有1個;I組中只包含ZmEXO70s和OsEXO70s蛋白，分別為6和16個;在親緣關系較近的F組和I組中，ZmEXO70s與OsEXO70s蛋白數(shù)量相近，但明顯多于AtEXO70s蛋白數(shù)量，其原因可能是十字花科植物進化為禾本科植物時水稻和玉米全基因組發(fā)生復制事件并保留下較多基因;H組中ZmEXO70s蛋白數(shù)量遠少于AtEXO70s蛋白數(shù)量，其原因可能是H組中編碼ZmEXO70s蛋白的基因在玉米全基因組復制事件中發(fā)生基因丟失現(xiàn)象（表2）。綜上所述，ZmEXO70s蛋白在系統(tǒng)發(fā)育進化上較保守，玉米基因組復制事件可能發(fā)生在禾本科植物分化之后，且大部分編碼ZmEXO70s蛋白的基因被保留，僅部分基因發(fā)生丟失。

2. 3 ZmEXO70基因結(jié)構與保守結(jié)構域分析結(jié)果

構建36個ZmEXO70s蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖2-A所示。36個ZmEXO70s分為9組，與表2相同。對ZmEXO70s基因結(jié)構進行序列結(jié)構分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因不含有內(nèi)含子，僅少數(shù)基因含內(nèi)含子，且內(nèi)含子數(shù)量不同，其中內(nèi)含子數(shù)最多是ZmEXO70D1b基因，含15個內(nèi)含子。為研究ZmEXO70s蛋白基序組成的多樣性和保守性，利用MEME對其保守基序進行分析，結(jié)果如圖2-B所示。36個ZmEXO70s蛋白共含8種基序（Motif 1～Motif 8），且各基序主要集中在基因的C端，暗示ZmEXO70s蛋白C端序列具有較高的保守性。從基序種類來看，B組、D組和E組的ZmEXO70s蛋白保守性更高，包含全部基序，其他組ZmEXO70s在基序種類分布上存在明顯差異，部分成員出現(xiàn)不同種類基序丟失現(xiàn)象，如ZmEXO70G1a蛋白只含有Motif 1，ZmEXO70F2c蛋白只含有Motif 3。此外，同一組內(nèi)的ZmEXO70s蛋白含有不同基序，如ZmEXO70A2蛋白缺少Motif 1、Motif 2和Motif 3，但ZmEXO70A1蛋白只含有Motif 1、Motif 2和Motif 3;ZmEXO70F2b和ZmEXO70F2d蛋白只含有Motif 2和Motif 3，ZmEXO70F2c蛋白只含有Motif 3。雖然8種基序的功能尚不明確，但通過Pfam分析保守結(jié)構域，結(jié)果顯示Motif 1～Motif 8組成Exo70保守結(jié)構域（圖2-C）。

已有研究證實EXO70蛋白C端含有多個高度保守且?guī)в姓姾傻膲A性氨基酸，與帶有負電荷的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸發(fā)生互作，促進胞泌復合體其他亞基募集至胞吐部位（Pe?enková et al.，2020）。為此，本研究將ZmEXO70s蛋白C端可能與質(zhì)膜脂質(zhì)互作有關的氨基酸序列進行多重比對分析，結(jié)果如圖3所示。與質(zhì)膜脂質(zhì)互作有關的氨基酸序列由65～75個氨基酸組成，包含11個堿性氨基酸（藍色星號）和9個酸性氨基酸（紅色星號），其中有多個氨基酸位點相對保守。除ZmEXO70A1、ZmEXO70G1a、ZmEXO70F2b、ZmEXO70F2c和ZmEXO70F2d不含該段氨基酸序列外，其余31個ZmEXO70s蛋白C端均含該段氨基酸序列。在11個堿性氨基酸中，除第1和10個堿性氨基酸以外，其余9個堿性氨基酸在ZmEXO70s蛋白中保守性較高。在9個酸性氨基酸中，除第1、5和6個以外，其余6個酸性氨基酸在ZmEXO70s中也具有較高的保守性。但目前對這些保守的酸性和堿性氨基酸在Exo70結(jié)構域中的功能尚不清楚，推測部分位點的氨基酸差異影響ZmEXO70s蛋白脂質(zhì)結(jié)合能力，進而影響蛋白在細胞中的定位，或是ZmEXO70s蛋白功能差異的重要決定因素。

2. 4 ZmEXO70s基因在不同組織及非生物脅迫下的表達分析結(jié)果

利用玉米B73的RNA-Seq數(shù)據(jù)（Sekhon et al.，2011），對36個ZmEXO70s基因在15個組織中的表達特性進行分析，結(jié)果如圖4-A所示。組間和組內(nèi)的ZmEXO70s基因表達水平均存在明顯差異，其中ZmEXO70A2、ZmEXO70F1a和ZmEXO70AF1b基因表達水平較高，其次是ZmEXO70B1、ZmEXO70B2a、ZmEXO70B2b、ZmEXO70D1a、ZmEXO70D1c、Zm-EXO70D2a、ZmEXO70D2b、ZmEXO70E1、ZmEXO70-F1a、ZmEXO70F1b、ZmEXO70F2a、ZmEXO70F2b、ZmEXO70G1b、ZmEXO70G1c和ZmEXO70G2等15個ZmEXO70s基因，表達水平也較高，推測這些Zm-EXO70s基因是玉米生長發(fā)育中的重要調(diào)控基因;剩余基因的表達水平相對較低。值得注意的是，Zm-EXO70B3基因在雄穗、花藥、葉片和花絲中高表達，ZmEXO70C1a基因僅在雄穗和花藥中高表達，ZmEXO70D2b基因在胚乳和萌發(fā)種子中低表達，ZmEXO70G1c基因在花絲和萌發(fā)種子中低表達。

利用Li等（2017）的RNA-Seq數(shù)據(jù)（PRJNA244661和PRJNA335771）分析ZmEXO70s基因在干旱、高溫、高鹽和低溫等非生物脅迫下的表達模式，結(jié)果如圖4-B所示。在36個ZmEXO70s基因中，有23個ZmEXO70s基因至少可響應一種非生物脅迫，說明這些ZmEXO70s基因響應非生物脅迫，其余13個ZmEXO70s基因可能表達量極低，在RNA-Seq數(shù)據(jù)中未檢測出。干旱脅迫下，ZmEXO70D1和ZmEXO70I2基因上調(diào)表達，ZmEXO70A1、ZmEXO70B3、ZmEXO-70D1a、ZmEXO70G1c和ZmEXO70I6基因下調(diào)表達。高溫脅迫下，ZmEXO70s基因表現(xiàn)出不同的表達模式，如ZmEXO70D2b、ZmEXO70E1、ZmEXO70F2a和ZmEXO70F4基因上調(diào)表達，而ZmEXO70F1b、ZmEXO70H1和ZmEXO70I6基因下調(diào)表達。高鹽脅迫和低溫脅迫下，大多數(shù)ZmEXO70s基因被誘導上調(diào)表達，僅少數(shù)基因表達受到抑制，如ZmEXO70G1c和ZmEXO70H1基因在高鹽和低溫脅迫下均下調(diào)表達，ZmEXO70A1和ZmEXO70A1基因在低溫脅迫下的表達輕微下調(diào)。推測大多數(shù)ZmEXO70s基因在非生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2. 5 ZmEXO70s基因遺傳變異與玉米苗期耐熱性的關聯(lián)分析結(jié)果

利用基因家族關聯(lián)分析方法檢測ZmEXO70s基因的遺傳變異與玉米苗期耐熱性是否關聯(lián)。玉米苗期耐熱性是以玉米3葉1心期植株經(jīng)持續(xù)高溫脅迫下植株存活率為衡量指標。首先對AM368群體ZmEXO70s基因進行SNP分析，結(jié)果如表3所示。有31個ZmEXO70s基因含SNP位點，平均SNP位點數(shù)為21個，其中以ZmEXO70F2a基因SNP位點數(shù)最多，達85個。隨后采用2種統(tǒng)計模型來分析基因型與表型間的相關性，結(jié)果如圖5所示。通過GLM分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70D2a、ZmEXO70E1和ZmEXO70I2基因的遺傳變異與苗期耐熱性存在顯著相關性（P≤0.01）。通過MLM分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因分別有2個SNP位點與苗期耐熱性呈極顯著相關（P≤0.001，下同）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70E1基因的2個SNP位點位于其5'-非編碼區(qū)（UTR）（圖6-A）;ZmEXO70D2a基因的2個SNP位點位于其編碼區(qū)（圖6-B）。

3 討論

玉米是目前我國種植面積最大的作物。隨著測序技術不斷發(fā)展和玉米全基因組測序的完成，為玉米基因家族鑒定、功能基因挖掘及基因功能研究等提供極有利的先決條件。雖然現(xiàn)已證實不同植物中EXO70s蛋白參與細胞壁形成、細胞分泌和抗逆應答等重要細胞學過程（Sekere? et al.，2017;Kulich et al.，2018），但目前鮮見有關ZmEXO70s基因家族的研究報道。本研從玉米基因組中共鑒定出36個ZmEXO70s基因，說明EXO70s蛋白在玉米中與其他植物一樣，均為多拷貝。植物EXO70s蛋白多拷貝現(xiàn)象可能是因為植物具有多種多樣的細胞壁及復雜的液泡結(jié)構，需要多種胞泌復合體滿足其適應環(huán)境的需要，進而演化出不同基因特有的調(diào)控機制（Elias et al.，2003;Chong et al.，2010）。ZmEXO70s基因家族成員數(shù)（36個）與高梁Ex070s（SbEXO70s）基因家庭數(shù)目（31個）相當，但比AtEXO70s基因家族成員數(shù)（23個）多，比OsEXO70s基因家族成員數(shù)（41個）少，可能是由于禾本科植物（水稻、玉米和高粱）在物種形成和進化過程中發(fā)生了全基因組復制和二倍體化，從而導致其EXO70s基因家族成員數(shù)目比十字花科的擬南芥多，且玉米和高粱在進化過程中經(jīng)歷染色體的丟失和融合，導致二者的EXO70s基因家族成員數(shù)目均比水稻少。

基因表達模式暗示其所行使的生物學功能。已有研究表明，胞泌復合體負責將高爾基囊泡栓系到細胞質(zhì)膜上，其基因缺失或突變均會導致其失去該生物學功能（Koumandou et al.，2007;Drdová et al.，2013）。本研究對36個ZmEXO70s基因在15個組織中的表達水平進行分析，結(jié)果顯示大多數(shù)Zm-EXO70s基因在玉米組織中均有表達，推測這些ZmEXO70s基因是玉米生長發(fā)育中重要調(diào)控基因，其中，ZmEXO70B3和ZmEXO70C1a基因在雄穗和花藥中高表達。Li等（2010）也研究發(fā)現(xiàn)，AtEXO70C1基因在成熟花粉中高效表達，當其發(fā)生突變后會導致花粉管生長遲緩，花粉的傳遞效率下降。可見，植物EXO70s基因家族中部分成員可能參與調(diào)控植株花粉發(fā)育過程。此外，已有研究表明，囊泡運輸相關蛋白通過參與非生物脅迫下的質(zhì)膜修復增加植物對低溫、高鹽等非生物脅迫的耐受性（Yamazaki et al.，2008;Kim and Bassham，2011;Drakakaki et al.，2012），但針對胞泌復合體在非生物脅迫應答響應過程的功能研究較少。本研究通過分析ZmEXO70s基因在干旱、高溫、高鹽和低溫等非生物脅迫下的表達模式，結(jié)果顯示36個ZmEXO70s基因中有23個ZmEXO70s至少響應一種非生物脅迫，暗示ZmEXO70s基因可能參與調(diào)控植物非生物脅迫響應過程，為進一步闡明植物胞泌復合體功能的分子機制提供理論依據(jù)。

雖然玉米來源于熱帶，但仍對高溫環(huán)境敏感，當氣溫超過35 ℃時，玉米植株整個生命周期（營養(yǎng)生長和生殖生長）均會受到影響（牛麗等，2015;Shi et al.，2017;石江等，2018），如春播玉米在抽雄吐絲期、夏播青儲玉米在幼苗出土期遭遇高溫熱害的問題在我國玉米生產(chǎn)上表現(xiàn)越來越突出（Hansen et al.，2001;Lesk et al.，2016）。雖然目前沒有研究直接證實，囊泡運輸與植物耐熱性相關，但已有研究證實囊泡運輸參與氣孔運動過程，如負調(diào)控擬南芥光誘導的氣孔開放因子ROP2和RIC7，通過抑制EXO70B1蛋白來阻止氣孔過度開放，說明EXO70B1通過介導囊泡運輸間接調(diào)控氣孔開放（Hong et al.，2016）。高溫脅迫下植物通過增大葉片氣孔開度，加快水分散失從而降低葉片溫度以適應高溫環(huán)境。由此可見，植物可能通過囊泡運輸調(diào)控氣孔運動從而響應高溫脅迫。本研究通過基因家族關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因的遺傳變異與玉米苗期耐熱性呈極顯著相關，且RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因的表達受高溫脅迫分別被抑制或誘導，故推測ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因參與玉米高溫脅迫響應過程，可作為提高玉米耐熱性的重要候選基因。但高溫脅迫下ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1是否調(diào)控玉米葉片氣孔的動態(tài)仍有待進一步研究。

4 結(jié)論

ZmEXO70s基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育進化上較保守，其基因組復制事件可能發(fā)生在禾本科植物分化后，且大多數(shù)ZmEXO70s基因被保留，僅部分基因被丟失。ZmEXO70s基因可能在非生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因可作為調(diào)控玉米苗期耐熱性的重要候選基因。

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（責任編輯 陳 燕）