李玉玉，牟怡曉，張 碩，馬聰慧，雷曉青，朱鴻福，張 歡，張桂杰

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，寧夏 銀川 750021；2.寧夏草牧業(yè)工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750021；3.天津云力之星生物科技有限公司，天津 300354）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的豆科牧草，其蛋白質(zhì)含量高，且含有動(dòng)物所需的多種礦物質(zhì)和維生素，因其優(yōu)良的飼用特性，被稱為“牧草之王”[1]。目前，我國苜蓿主要加工方式是干草制作，調(diào)制過程中苜蓿自然曬干較為困難，易發(fā)霉變質(zhì)，且干草飼喂?fàn)I養(yǎng)損失較大[2]。因此，將苜蓿制成青貯飼料，不僅可以延長貯存時(shí)間，還可以有效減少營養(yǎng)損失，提高其適口性和消化率。對于牧場來說，青貯苜蓿是可靠又經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)飼料，提升青貯飼料品質(zhì)、提高青貯飼料用量是中小型牧場降本增效的有效措施之一。因而，越來越多從事苜蓿生產(chǎn)的企業(yè)開始關(guān)注苜蓿青貯的調(diào)制，青貯飼料的制備也趨于機(jī)械化和自動(dòng)化[3]。在國家“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”計(jì)劃支持下，寧夏大力發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)，建設(shè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿示范區(qū)，使得優(yōu)質(zhì)苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大。寧夏地區(qū)第2茬至第4茬(6月至8月)苜蓿收割期，正值雨熱同期，這為調(diào)制干草帶來了挑戰(zhàn)。隨著牧場對苜蓿青貯的認(rèn)可度越來越高，寧夏苜蓿青貯生產(chǎn)空間巨大，可有效促進(jìn)苜蓿產(chǎn)業(yè)和奶業(yè)的發(fā)展[4]。

由于紫花苜蓿刈割時(shí)水分含量較高，可溶性碳水化合物含量少，附著的乳酸菌較少，緩沖能較高，因此難以單獨(dú)青貯[5]。已有研究證實(shí)[6-10]，生物添加劑如乳酸桿菌和纖維素酶等可以有效改善青貯品質(zhì)。其中，纖維素酶可以降解植物細(xì)胞壁，將多糖水解為單糖，增加青貯發(fā)酵底物，產(chǎn)生大量乳酸和少量乙酸，降低pH，提高發(fā)酵品質(zhì)[11]；研究表明，纖維素酶能夠降低中性洗滌纖維濃度且對未成熟植株作用效果更強(qiáng)[12]；纖維素酶還可改善飼料青貯品質(zhì)[13-14]。目前關(guān)于纖維素酶調(diào)控青貯品質(zhì)的研究主要集中在單一纖維素酶對飼草青貯品質(zhì)的影響[15-17]，為此，本研究選擇青貯專用復(fù)合纖維素酶，探究其對苜蓿青貯的營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量及有氧穩(wěn)定性的影響，為提高苜蓿青貯品質(zhì)和拓寬草食家畜優(yōu)質(zhì)飼草料來源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)原料

試驗(yàn)選用寧夏茂盛草業(yè)公司種植的“中苜4號(hào)”紫花苜蓿，于2018年5月19 日現(xiàn)蕾期–始花期刈割，留茬高度7 cm。刈割后，苜蓿陰干，由Aurora 型手持式近紅外光譜儀，確定水分含量下降至65%左右進(jìn)行青貯。苜蓿營養(yǎng)成分含量分別為干物質(zhì)37.40%，粗蛋白19.33%，粗脂肪1.90%，可溶性碳水化合物2.03%，中性洗滌纖維48.54%，酸性洗滌纖維37.32%，酸性洗滌木質(zhì)素6.12%，纖維素31.33%，相對飼喂價(jià)值為114.65。

1.1.2試驗(yàn)添加劑

試驗(yàn)所用青貯復(fù)合纖維素酶由天津云力之星生物科技有限公司饋贈(zèng)，是一種專用于苜蓿青貯的復(fù)合酶制劑，其中纖維素酶活力≥60 000 U·g?1，木聚糖酶活力≥ 2 500 U·g?1，淀粉酶活力≥ 300 000 U·g?1，β-葡聚糖酶活力≥300 000 U·g?1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，對照組(T1組)不添加青貯專用復(fù)合纖維素酶，T2組、T3組、T4組分別添加2.5‰、5.0‰和7.5‰青貯專用復(fù)合纖維素酶，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。苜蓿原料用鍘刀鍘成2 cm的小段，將纖維素酶均勻地拌于原料之中，裝于單向氣閥的青貯袋(20 cm ×30 cm)中進(jìn)行真空壓縮密封，密封后密度為705～725 kg·m?3，室溫25℃，青貯時(shí)間60 d。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1營養(yǎng)成分

分別取適量液氮中苜蓿和500 g 青貯料置于凍干機(jī)中凍干，凍干后再次稱量，計(jì)算干物質(zhì)(dry matter,DM)經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過0.425 mm 孔徑篩，裝袋置干燥處保存。粗蛋白(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract,EE)、可 溶 性 碳 水 化 合 物(water soluble carbohydrate,WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin,ADL)、粗纖維(crude fiber,CF)含量參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[18]進(jìn)行測定。相對飼喂價(jià)值(relative feed value,RFV)計(jì)算方法為：

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)

pH測定方式：稱取5 g 樣品于錐形瓶中，加入45 mL 蒸餾水，振蕩30 min，并使樣品完全浸入水中，用封口膜封口，于4℃下保存24 h，用4層紗布過濾取上清液，使用雷磁PHS-3G 精密pH 計(jì)進(jìn)行測定。

氨態(tài)氮/總氮(NH3-N/TN)采用苯酚–次氯酸鈉比色法測定；乳酸(lactic acid,LA)使用試劑盒測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)的測定：取濾液0.5 mL，加入等體積的8.2%偏磷酸，13 000 r·min?1離心10 min，取上清液加入內(nèi)標(biāo)巴豆酸，使用GCMS-TQ8040型氣相色譜儀(日本島津公司)，Rtx?-Wax 毛細(xì)管色譜柱，分析測定上清液中丙酸、乙酸及丁酸的含量。

1.3.3微生物和有氧穩(wěn)定性

乳酸菌、酵母菌、霉菌數(shù)量的測定使用稀釋涂布平板法，選用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌和霉菌。乳酸菌選擇培養(yǎng)基上光滑、圓形的白色菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，酵母菌計(jì)數(shù)選擇培養(yǎng)基上濕潤、光滑、不透明、大而厚的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。霉菌選擇為培養(yǎng)基上菌絲細(xì)長、菌落疏松呈絨毛狀面絮狀的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，菌落計(jì)數(shù)單位用lg cfu·g?1表示。

有氧穩(wěn)定性的測定：在發(fā)酵60 d 后打開全部發(fā)酵袋青貯，將溫度記錄儀(HOBO Pendant Temperature/Light，USA)放入發(fā)酵袋幾何中心處，封口并在青貯袋上刺小孔，置于室溫(26℃)下保存，使空氣可以自由進(jìn)入袋中。同時(shí)在室內(nèi)不同位置放置3個(gè)溫度記錄儀。若青貯袋中的溫度高于室溫2℃，則說明青貯開始腐敗變質(zhì)，計(jì)算開袋至腐敗變質(zhì)的時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel對數(shù)據(jù)預(yù)處理，再使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行ANOVA 方差分析比較均值，并采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

T2、T3和T4組CP含量均高于T1組，T4組的CP含量最高(表1)，顯著高于T1組(P<0.05)；各組間EE 無顯著性差異(P>0.05)；T3組WSC含量極顯著高于其他處理組(P<0.01)；纖維素酶處理青貯中CF含量極顯著低于T1組，且T3組極顯著低于T2組(P<0.01)；T3組NDF含量極顯著低于其他處理組(P<0.01)；T3組與T4組的ADF 含量與RFV值極顯著低于或高于T1組和T2組(P<0.01)；纖維素酶處理組ADL 含量極顯著高于T1組(P<0.01)，但處理組間差異不顯著(P>0.05)。

表1 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響Table 1 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage nutrition components

2.2 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

如表2所列，添加纖維素酶可極顯著降低青貯pH(P<0.01)，其中T2組最低，為4.43，酶處理組間差異不顯著(P>0.05)。纖維素酶處理組氨態(tài)氮含量極顯著低于T1組(P<0.01)。添加纖維素酶的3個(gè)處理組中，乳酸含量隨纖維素酶添加量的增加而降低，T2組與T3組均極顯著高于T1組(P<0.01)，T4組與T1組差異不顯著(P>0.05)。T2組和T3組的乙酸含量極顯著低于T1組(P<0.01)，而T4組與T1組差異不顯著。T3、T4組的丙酸含量極顯著高于處理T1、T2組(P<0.01)，但T1、T2組之間丙酸含量差異不顯著(P>0.05)，T3、T4組之間丙酸含量差異亦不顯著(P>0.05)。丁酸含量在T3組未檢測到，其余各組含量較少且各組無差異。

表2 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 2 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage fermentation quality

2.3 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯微生物的影響

如表3所列，乳酸菌、霉菌數(shù)量隨開袋時(shí)間增長呈現(xiàn)增加趨勢，酵母菌在開袋第3天數(shù)量下降，然后升高。開袋后第1天T3組乳酸菌含量顯著低于其他3組(P< 0.05)；T1組中的酵母菌數(shù)量極顯著高于其他3個(gè)組(P<0.01)，霉菌數(shù)量最低，為3.30 lg cfu·g?1。第3天T4組的乳酸菌數(shù)量顯著高于其他3個(gè)組(P<0.05)，達(dá)7.46 lg cfu·g?1，4個(gè)處理組的霉菌數(shù)量差異不顯著(P>0.05)，T2組的酵母菌數(shù)量極顯著低于T1組和T3組(P<0.01)。開袋第6天T4組乳酸菌數(shù)量顯著高于其他3個(gè)組(P<0.05)，T1組的酵母菌數(shù)量極顯著高于其他3個(gè)組(P<0.01)，且T2組的酵母菌數(shù)量最低。

表3 不同處理組間苜蓿青貯開袋后微生物動(dòng)態(tài)變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Dynamic changesbetween different treatmentson microbial populationsafter opening daysof alfalfa silage(DM basis)

2.4 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯有氧穩(wěn)定性的影響

在有氧暴露后，青貯料的有氧穩(wěn)定性時(shí)間表現(xiàn)T3組最長(53.5 h)，T1組最短(51 h)。T1和T4組有氧暴露時(shí)間顯著低于T2和T3組(P< 0.05)(圖1)。

圖1 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯有氧穩(wěn)定性的影響Figure 1 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage aerobic stability

2.5 苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)V-score評分分析

采用V-score評分體系對4組青貯的品質(zhì)進(jìn)行綜合分析(表4)。結(jié)果表明，各組的青貯飼料總體評價(jià)均為良好(> 80分)，其中T3組的得分最高。

表4 不同處理組間苜蓿青貯V-score評分Table 4 V-score of different treatmentson microbial populations

3 討論

3.1 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

纖維素酶可以將青貯原料中的結(jié)構(gòu)性糖類降解為單糖或雙糖，為乳酸的生成提供可利用發(fā)酵底物，同時(shí)纖維素酶中含有氧化還原酶，可以加快氧氣的消耗，為青貯提供厭氧環(huán)境，抑制腐敗菌的生長[19-21]。纖維素酶屬于青貯發(fā)酵促進(jìn)劑，利用纖維素酶對青貯纖維素進(jìn)行分解，增加可溶性碳水化合物含量，為乳酸菌活動(dòng)提供能源，纖維素酶不引起蛋白質(zhì)的分解，不降低粗蛋白含量[22]，這與本研究中處理組粗蛋白含量均高于對照組粗蛋白質(zhì)含量的結(jié)果一致。而T3組氨態(tài)氮較高且乳酸菌含量較少，有害微生物快速生長，蛋白質(zhì)的降解作用增強(qiáng)[23]，由此可解釋添加纖維素酶的3個(gè)處理組中T3組粗蛋白含量相對最低。本研究中添加青貯專用復(fù)合纖維素酶有效降低苜蓿青貯中NDF和ADF含量，這與徐然等[14]對光葉紫花苕(Vicia villosaRoth)的研究結(jié)果一致。木質(zhì)素是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子聚合物，真菌、細(xì)菌、放線菌等微生物和其他酶類物質(zhì)可以有效降解木質(zhì)素，但木質(zhì)素在厭氧條件下很難被降解。由于添加纖維素酶使得苜蓿青貯中氧氣消耗加快，有效抑制好氧微生物和其他酶類對木質(zhì)素的降解，所以在本研究中添加纖維素酶并沒有起到降低木質(zhì)素的作用[24-26]。T3組可溶性碳水化合物含量最高，且NDF含量顯著低于其他3組，說明纖維素酶水解植物細(xì)胞壁產(chǎn)生的過量可溶性碳水化合物未被微生物完全利用[27]。T4組開袋第1 天乳酸菌含量高于其他3組，其他微生物含量也偏高，故T4組可溶性碳水化合物含量低于T3組。

3.2 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH和氨態(tài)氮是評定青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。各處理的乳酸含量均高于其他有機(jī)酸，乙酸含量高于丙酸和丁酸。因此，苜蓿青貯發(fā)酵屬于乳酸發(fā)酵與醋酸發(fā)酵相結(jié)合的混合型發(fā)酵，乳酸含量高是造成青貯pH 低的主要原因[28]。當(dāng)苜蓿青貯中pH 迅速降至4.7以下時(shí)，抑制了有害菌丁酸梭菌的生長，乳酸菌成為優(yōu)勢菌群進(jìn)行繁殖，加速乳酸的積累，并產(chǎn)生少量的乙酸?？扇苄蕴妓衔锏暮咳Q于乳酸菌的繁殖速度和酶解產(chǎn)糖之間的平衡，發(fā)酵過程中部分糖會(huì)轉(zhuǎn)化成乙醇，使青貯具有酒香味。纖維素酶的添加增加了乳酸的產(chǎn)量[29]，然而，在纖維素酶一定作用范圍內(nèi)，過多的纖維素酶不利于乳酸菌與發(fā)酵底物的接觸[13]，導(dǎo)致乳酸含量下降。這也是本研究中纖維素酶3個(gè)處理組乳酸含量依次下降的原因之一，這與陳鑫珠等[13]對常規(guī)水分和低水分稻草青貯品質(zhì)的影響研究結(jié)果一致。

丙酸在3種有機(jī)酸中抗真菌能力較強(qiáng)，但酸性最弱，其抑菌作用隨pH降低而增強(qiáng)[30]。Hristov[31]研究表明，添加纖維素酶、半纖維素酶等添加劑可以降低燕麥(Avena sativa)和普通黃耆(Astragalus propinquus)混合青貯飼料中氨態(tài)氮的生成量，這與本研究結(jié)果相反，可能是由于本研究以苜蓿為原料，青貯中蛋白含量高所引起。苜蓿青貯中丁酸梭菌可以產(chǎn)生丁酸，也可以分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨態(tài)氮，影響青貯氣味，降低適口性，影響采食[32-34]，T3組的青貯中并未檢測到丁酸，且氨態(tài)氮顯著高于其他3組，是由于蛋白自身過度降解所致。

3.3 青貯專用復(fù)合纖維素酶對苜蓿青貯微生物和有氧穩(wěn)定性的影響

乳酸菌是青貯中起主要發(fā)酵作用的有益微生物，可以在厭氧條件下利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸。在厭氧條件下，酵母菌可以利用青貯中的糖類繁殖并產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，使其具有酒香味，但酵母菌的劇烈活動(dòng)會(huì)引起青貯的二次發(fā)酵，不利于貯藏[35]。本研究中，無添加組的乳酸菌含量最低，酵母菌的含量最高，添加復(fù)合纖維素酶的青貯料中酵母菌含量降低，這與侯美玲等[36]對羊草(Leymus chinense)青貯品質(zhì)研究結(jié)果相同，說明纖維素酶的添加降低青貯料pH 是有效抑制了酵母菌的繁殖所致。

在青貯開袋后，由于青貯料與空氣接觸，導(dǎo)致青貯中的好氧微生物開始活躍，使得青貯料變質(zhì)進(jìn)程開始，其中好氧微生物利用青貯中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量繁殖[37]。隨著有氧暴露時(shí)間的增加，霉菌和酵母菌數(shù)量迅速上升，乳酸菌數(shù)量增長緩慢，與劉立山等[38]研究中乳酸菌數(shù)量降低的結(jié)果相反，這可能是因?yàn)楹醚蹙目焖俜敝诚那噘A中的氧氣，使厭氧菌進(jìn)行緩慢繁殖。苜蓿青貯在開袋51～53 h 后已經(jīng)開始變質(zhì)，說明好氧微生物的霉菌和酵母菌開始快速繁殖。較低的pH 為青貯提供了穩(wěn)定的發(fā)酵環(huán)境，可以更好地抑制腐敗菌的生長，使有氧穩(wěn)定時(shí)間延長，而酵母菌可以利用乳酸產(chǎn)生酒精，并發(fā)生有氧變質(zhì)[36]。添加酶制劑的3個(gè)組的有氧穩(wěn)定性高于對照組，其中T3組的有氧穩(wěn)定性最好；此外T2組和T3組的乳酸含量較高，乳酸具有一定的抗菌性，因此T2組和T3組的苜蓿青貯有氧穩(wěn)定性顯著提高。

4 結(jié)論

本研究對4組添加不同濃度青貯專用復(fù)合纖維素酶的苜蓿青貯營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)、微生物和有氧穩(wěn)定性等指標(biāo)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，各組苜蓿青貯品質(zhì)評定均能達(dá)到良好青貯品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。添加復(fù)合纖維素酶降低了青貯苜蓿中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量，減少了干物質(zhì)損失，提高了苜蓿青貯營養(yǎng)價(jià)值；添加復(fù)合纖維素酶還可降低苜蓿青貯pH 和乙酸含量，提高乳酸含量和有氧穩(wěn)定性，改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。研究結(jié)果表明，4個(gè)處理組的青貯品質(zhì)表現(xiàn)為T3組(5.0‰) >T2組(2.5‰)>T4組(7.5‰)>T1組(0)，即添加5.0‰的青貯專用復(fù)合纖維素酶青貯效果最好。