王興迪，田 沛

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州 730020）

禾草內(nèi)生真菌(Grassendophyte)指在禾草體內(nèi)渡過(guò)全部或大部分生活周期，而禾草本身不顯示任何外部癥狀的一大類(lèi)真菌[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)禾草內(nèi)生真菌的研究主要集中在子囊菌門(mén)(Ascomycota)麥角科(Clavicipitaceae)的Epichlo?屬[2]。禾草內(nèi)生真菌與禾草形成互惠共生體，即禾草為內(nèi)生真菌提供生存空間以及糖類(lèi)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持其生長(zhǎng)，內(nèi)生真菌通過(guò)合成生物堿等次生代謝物來(lái)抵御害蟲(chóng)、家畜等生物對(duì)宿主的侵害以及改善禾草對(duì)干旱、鹽堿、重金屬等非生物脅迫的抵抗能力[3-5]。內(nèi)生真菌菌絲體主要集中分布于禾草地上部分[6-8]。且主要依靠種子進(jìn)行垂直傳播[9-11]，其形態(tài)特征以及生長(zhǎng)特性具有豐富的多樣性[12]。

中華羊茅(Festuca sinensis)是青藏高原草地植被群落中的主要伴生種，在青藏高原有豐富的野生資源分布，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)良特性，是天然草地改良、退化草地恢復(fù)和生態(tài)建設(shè)中最適宜的優(yōu)良草種之一[13]。中華羊茅對(duì)不良環(huán)境如干旱、寒冷及鹽堿脅迫等有較強(qiáng)的抵抗力，已在氣候惡劣的高海拔三江源區(qū)引種栽培成功[13]。目前已知中華羊茅多被Epichlo?屬內(nèi)生真菌侵染，二者形成互惠共生體[14]。大量研究表明，Epichlo?內(nèi)生真菌可提高宿主中華羊茅在逆境脅迫下的耐受能力[14-17]。干旱脅迫條件下，內(nèi)生真菌促使中華羊茅地上生物量以及地下生物量增加，促進(jìn)中華羊茅種子的萌發(fā)，提高可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量[14]。寒冷脅迫下，內(nèi)生真菌可提高帶菌中華羊茅種子萌發(fā)率，縮短帶菌中華羊茅種子萌發(fā)時(shí)間[15]。鹽脅迫條件下，內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)[16]。且?guī)Ь闹腥A羊茅與其他禾草混播時(shí)，內(nèi)生真菌能增加中華羊茅的競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)伴生植物的生長(zhǎng)，提高草地群落的穩(wěn)定性[17]。以上研究結(jié)果均說(shuō)明內(nèi)生真菌的存在對(duì)中華羊茅生長(zhǎng)過(guò)程中的重要性。

目前此內(nèi)生真菌已被鑒定為Epichlo?sinensis。前人研究已確定E. sinensis有豐富的生物多樣性[18]。楊洋[19]發(fā)現(xiàn)分離自同一地區(qū)中華羊茅種子中不同的內(nèi)生真菌菌株，其生長(zhǎng)速度、菌落特征和孢子形態(tài)存在差異。金文進(jìn)等[20]研究也發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基、溫度、pH 以及營(yíng)養(yǎng)成分均對(duì)分布于甘肅的E.sinensis菌株的生長(zhǎng)有影響。王美寧[21]發(fā)現(xiàn)不同維生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及金屬離子均對(duì)分布于5個(gè)不同地理區(qū)域的中華羊茅內(nèi)生真菌菌株的生長(zhǎng)有影響，且5 個(gè)不同地理區(qū)域的E. sinensis菌株存在顯著差異。

植物在受到非生物脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基，自由基會(huì)損傷蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子并引起膜脂過(guò)氧化，植物可以通過(guò)提高自身抗氧化能力來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的傷害，這也是植物抗非生物脅迫的主要機(jī)理之一[22]。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌是一種具有較大潛力的天然抗氧化劑。高媛等[23]研究發(fā)現(xiàn)，疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)淹水前根部分離得到的內(nèi)生真菌SG17具有強(qiáng)抗氧化活性。Tianpanich 等[24]從一株內(nèi)生真菌(Colletotrichum)分離出的5種化合物均具有良好的抗氧化能力。

綜上所述，目前離體條件下對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌不同菌株生長(zhǎng)影響的研究主要集中在不同溫度、pH、維生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及重金屬元素等方面，而不同碳氮源對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌生長(zhǎng)及總抗氧化能力的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。基于此，為進(jìn)一步篩選出適宜于不同E.sinensis菌株的碳氮源，本研究擬檢測(cè)不同碳氮源培養(yǎng)基上從不同生態(tài)型中華羊茅宿主中分離的內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)情況。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1供試菌株

菌株1分離自甘肅省夏河縣野生中華羊茅種子，菌株41C分離自青海省平安縣野生中華羊茅種子，菌株111C分離自四川省紅原縣野生中華羊茅種子，均由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護(hù)研究所提供，已明確其均為Epichlo? sinensis[25]。各菌株均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基上低溫保存，試驗(yàn)前接種于新鮮的PDA 培養(yǎng)基上，于(25±1)℃黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)28 d 備用。

1.1.2固體培養(yǎng)基制備

基礎(chǔ)成分：去皮馬鈴薯(Solanum tuberosum)200 g 煮汁、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加碳、氮含量等量的碳氮源，即葡萄糖20 g、淀粉29.96 g、麥芽糖33.32 g、甘露醇19.96 g、山梨醇19.96 g 及氯化銨19.10 g、蛋白胨34.48 g、胰蛋白胨36.69 g、酵母浸粉38.12 g、尿素10.72 g(下同)，制成不同的碳、氮源培養(yǎng)基[24]，分裝入90 mm 直徑的培養(yǎng)皿中，每皿約30 mL，每個(gè)菌株每種處理均為5個(gè)重復(fù)。待培養(yǎng)皿冷卻后，放入一層透氣膜(賽璐玢)。

1.1.3液體培養(yǎng)基的制備

基礎(chǔ)成分：去皮馬鈴薯200 g 煮汁、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加碳、氮含量等量的葡萄糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇、山梨醇以及氯化銨、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、尿素，制成不同的碳、氮源培養(yǎng)基，分裝入250 mL的錐形瓶中，每瓶100 mL，每個(gè)菌株每種處理均為5個(gè)重復(fù)[26]。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1菌落直徑

將已活化的3株內(nèi)生真菌菌株用6 mm 打孔器打孔，接于不同碳、氮源固體培養(yǎng)基上，在(25±1)℃黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4周，每周(7 d)用十字法測(cè)量菌株直徑。

1.2.2菌落生長(zhǎng)速率

菌落生長(zhǎng)速率=(菌落菌絲直徑?初始接菌落菌絲直徑)/菌落培養(yǎng)時(shí)間[27]。

1.2.3菌絲直徑

在收獲菌絲之前，用膠帶粘貼法獲取菌絲后用熒光顯微鏡(OLYMPUS,BX51)直接測(cè)量菌絲直徑。

1.2.4菌絲生物量

揭開(kāi)透氣膜，用解剖刀將菌絲輕輕刮取，放入Eppendorf 管中，稱(chēng)量鮮重。

1.2.5總抗氧化能力測(cè)定

將已活化的3株內(nèi)生真菌菌株用6 mm 打孔器打孔，接于不同碳、氮源液體培養(yǎng)基中，在(25±1)℃、148 r·min?1搖床上培養(yǎng)3 周，使用總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒測(cè)定(南京建成生物工程有限公司)，發(fā)酵菌懸液過(guò)濾菌體，濾液10 000 r·min?1離心10 min，將所獲得的上清液按照試劑盒內(nèi)置的方法反應(yīng)，在波長(zhǎng)520 nm 處測(cè)定吸光 值。計(jì)算公式 如 下：T?AOC(U·mL?1) =(ODU–ODC)/N×0.3；式中：ODU(optical density unit)為測(cè)定樣品吸光度值，ODC(optical density contrast)為對(duì)照吸光度值，N為反應(yīng)液總體積/取樣量[21]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)同一菌株不同碳氮源處理、同一碳氮源處理不同菌株處理進(jìn)行單因素方差分析；采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)Epichlo? sinensis 生長(zhǎng)的影響

2.1.1不同碳源對(duì)Epichlo? sinensis菌落直徑的影響

3株Epichlo? sinensis在不同碳源條件下的菌落直徑存在不同差異，其中6種碳源處理?xiàng)l件下，菌株111C 的菌落直徑均顯著高于菌株41C和菌株1(P<0.05)(表1)。以葡萄糖為碳源時(shí)，3株菌株的菌落直徑間均有顯著差異(P<0.05)，且菌落直徑表現(xiàn)為111C>1 >41C；在以山梨醇為碳源時(shí)，3株菌株的菌落直徑間也均有顯著差異(P<0.05)，且菌落直徑表現(xiàn)為111C>41C>1；以麥芽糖、淀粉、甘露醇為碳源的處理?xiàng)l件下，111C的菌落直徑顯著大于菌落41C和1(P<0.05)，但菌落41C和菌落1之間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 不同碳源條件下Epichlo? sinensis 生長(zhǎng)4周的菌落直徑、菌絲直徑和菌絲鮮重Table 1 Colony diameters,hypha diametersand mycelium biomass of Epichlo? sinensis grown using different carbon sourcesfor 4 weeks

不同碳源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的菌落直徑均有明顯影響(表1)。菌株1在有葡萄糖、麥芽糖的培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著高于其他成分培養(yǎng)基(P<0.05)，而有淀粉、甘露醇的培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著高于山梨醇培養(yǎng)基(P< 0.05)。菌株41C在有麥芽糖的培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著高于甘露醇、葡萄糖培養(yǎng)基(P<0.05)，而這3種碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑與淀粉、山梨醇培養(yǎng)基之間差異不顯著(P>0.05)。菌株111C在有淀粉的培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著高于山梨醇培養(yǎng)基(P<0.05)，而這兩種碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑與甘露醇、麥芽糖、葡萄糖培養(yǎng)基之間差異不顯著(P> 0.05)。

2.1.2不同碳源對(duì)Epichlo? sinensis菌絲直徑的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在不同碳源條件下的菌絲直徑存在明顯差異(表1)。3株菌株的菌絲直徑在以淀粉、麥芽糖、甘露醇、山梨醇為處理的條件下，菌株1、41C的菌絲直徑顯著高于111C(P<0.05)；以葡萄糖為處理的條件下，菌株41C 的菌絲直徑顯著高于菌株1、111C(P<0.05)。

不同碳源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的菌絲直徑均有明顯影響(表1)。菌株1的菌絲直徑在不同碳源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，而有甘露醇的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于其他4種培養(yǎng)基(P<0.05)，而有淀粉、山梨醇的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于麥芽糖、葡萄糖培養(yǎng)基(P< 0.05)。菌株41C的菌絲直徑在不同碳源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，有葡萄糖、甘露醇培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于淀粉、山梨醇、麥芽糖培養(yǎng)基(P<0.05)。菌株111C的菌絲直徑在不同碳源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有甘露醇、山梨醇、葡萄糖的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于麥芽糖、淀粉培養(yǎng)基(P<0.05)，而有淀粉的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著低于麥芽糖培養(yǎng)基(P< 0.05)。

2.1.3不同碳源對(duì)Epichlo? sinensis菌絲鮮重的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在不同碳源條件下的菌絲鮮重存在明顯差異(表1)。3株菌株的菌絲鮮重在以淀粉、甘露醇、山梨醇為處理的條件下均有顯著差異(P< 0.05)，且菌絲鮮重表現(xiàn)為111C > 41C >1；以葡萄糖、麥芽糖為處理的條件下，111C 的菌絲鮮重顯著大于菌株41C和1(P< 0.05)。

不同碳源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的菌絲鮮重均有明顯影響(表1)。菌株1的菌絲鮮重在不同固體培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有葡萄糖的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于其他4種培養(yǎng)基(P<0.05)，而有山梨醇、麥芽糖的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于淀粉培養(yǎng)基(P< 0.05)。菌株41C的菌絲鮮重在不同固體培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有葡萄糖培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于其他4種培養(yǎng)基(P<0.05)，而有甘露醇、山梨醇的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于麥芽糖、淀粉培養(yǎng)基(P<0.05)，且在有麥芽糖培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于淀粉培養(yǎng)基(P<0.05)。菌株111C的菌絲鮮重在不同碳源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有麥芽糖的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于其他4種培養(yǎng)基(P<0.05)，而有甘露醇、葡萄糖的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于淀粉、山梨醇培養(yǎng)基(P< 0.05)。

2.1.4不同碳源對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌總抗氧化能力的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在不同碳源條件下的總抗氧化能力存在明顯差異(P<0.05)(圖1)。在以葡萄糖、淀粉為碳源的條件下，3株菌株的總抗氧化能力均有顯著差異(P<0.05)，且總抗氧化能力表現(xiàn)為111C>1 >41C；以麥芽糖、甘露醇、山梨醇為碳源的條件下，菌株111C的總抗氧化能力顯著高于菌株1和41C(P< 0.05)。

不同碳源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的總抗氧化能力均有不同影響(圖1)。菌株1的總抗氧化能力在不同碳源發(fā)酵液中均無(wú)顯著差異(P<0.05)。菌株41C在麥芽糖發(fā)酵液中的總抗氧化能力顯著高于葡萄糖、淀粉發(fā)酵液(P<0.05)。菌株111C在葡萄糖、麥芽糖發(fā)酵液中總抗氧化能力顯著高于淀粉、山梨醇發(fā)酵液(P<0.05)，在甘露醇發(fā)酵液中總抗氧化能力則與上述4種發(fā)酵液間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同碳源條件下Epichlo? sinensis菌株的發(fā)酵液的總抗氧化能力Figure1 Total antioxidant capacitiesof fermented extractsof Epichlo? sinensis grown using different carbon sources

2.2 不同氮源對(duì)Epichlo? sinensis 生長(zhǎng)的影響

2.2.1不同氮源對(duì)Epichlo? sinensis菌落直徑的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在不同氮源條件下的菌落直徑存在明顯差異(P<0.05)，其中3株中華羊茅菌株在以尿素為氮源時(shí)均不生長(zhǎng)，且菌株111C的菌落直徑在除尿素外的不同氮源條件下均顯著高于菌株41C和1(P<0.05)(表2)。在以胰蛋白胨、氯化銨和酵母浸粉為處理的條件下，3株菌株的菌落直徑均有顯著差異(P<0.05)，且菌落直徑表現(xiàn)為111C>41C>1；以蛋白胨為處理的條件下，111C的菌落直徑顯著大于菌落41C和1(P< 0.05)。

氮源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的菌落直徑均有明顯影響(P< 0.05)，3株菌株均不能吸收利用尿素(表2)。菌株1和41C的菌落直徑在除尿素外的不同氮源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有胰蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌落直徑均顯著高于其余4種培養(yǎng)基(P<0.05)，其余4種有蛋白胨、氯化銨、酵母浸粉和尿素的培養(yǎng)基上菌落直徑均有顯著差異(P<0.05)，菌株1 和41C的菌落直徑表現(xiàn)為胰蛋白胨>蛋白胨> 氯化銨>酵母浸粉> 尿素。菌株111C的菌落直徑則表現(xiàn)為胰蛋白胨>蛋白胨>酵母浸粉>氯化銨>尿素。

2.2.2不同氮源對(duì)Epichlo? sinensis菌絲直徑的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在除尿素外的不同氮源條件下的菌絲直徑存在明顯差異(表2)。3株菌株的菌絲直徑在以氯化銨、胰蛋白胨、蛋白胨為氮源的條件下均無(wú)顯著差異(P>0.05)，且以氯化銨為氮源時(shí)菌絲直徑表現(xiàn)為41C> 1>111C、以蛋白胨為氮源時(shí)菌絲直徑表現(xiàn)為41C > 111C>1、以胰蛋白胨為氮源時(shí)菌絲直徑表現(xiàn)為111C> 1>41C，以酵母浸粉為氮源的條件下，菌株1和41C的菌絲直徑顯著高于菌株111C(P< 0.05)。

表2 不同氮源條件下Epichlo? sinensis 生長(zhǎng)4周的菌落直徑Table 2 Colony diameters,hypha diametersand mycelium biomass of Epichlo? sinensis grown using different nitrogen sourcesfor 4 weeks

不同氮源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的菌絲直徑均有明顯影響(表2)。菌株1的菌絲直徑在不同氮源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有酵母浸粉的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于其他成分培養(yǎng)基(P<0.05)，而有氯化銨的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于蛋白胨、胰蛋白胨培養(yǎng)基(P<0.05)。菌株41C的菌絲直徑在不同氮源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，有酵母浸粉、氯化銨的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于其他2種培養(yǎng)基(P<0.05)，而在有蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于胰蛋白胨培養(yǎng)基(P<0.05)。菌株111C的菌絲直徑在不同氮源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，有酵母浸粉、氯化銨的培養(yǎng)基上的菌絲直徑顯著高于蛋白胨、胰蛋白胨培養(yǎng)基(P< 0.05)。

2.2.3不同氮源對(duì)Epichlo? sinensis菌絲鮮重的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在不同氮源條件下的菌絲鮮重存在明顯差異(表2)。3株菌株的菌絲鮮重在以胰蛋白胨、氯化銨為處理的條件下，3株菌株的菌絲鮮重均有顯著差異(P<0.05)，且菌絲鮮重表現(xiàn)為111C >1>41C；以酵母浸粉為處理的條件下，3 株菌株的菌絲鮮重均有顯著差異(P<0.05)，且菌絲鮮重表現(xiàn)為111C>41C>1；以蛋白胨為處理的條件下，菌株111C的菌絲鮮重顯著大于菌株1和41C(P< 0.05)。

不同氮源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的菌絲鮮重均有明顯影響(表2)。菌株1的菌絲鮮重在不同氮源培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有胰蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于其他3種培養(yǎng)基(P<0.05)，而有蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于酵母浸粉、氯化銨培養(yǎng)基(P<0.05)。菌株41C的菌絲鮮重在不同固體培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于氯化銨培養(yǎng)基(P<0.05)。菌株111C 的菌絲鮮重在不同固體培養(yǎng)基上有顯著差異(P<0.05)，在有胰蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于其他3種培養(yǎng)基(P<0.05)，而有蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲鮮重顯著高于酵母浸粉和氯化銨培養(yǎng)基上的(P<0.05)。

2.2.4不同氮源對(duì)Epichlo? sinensis總抗氧化能力的影響

3株Epichlo? sinensis菌株在不同氮源條件下的總抗氧化能力存在明顯差異(圖2)。在以尿素、氯化銨、酵母浸粉為氮源的條件下，3株菌株的總抗氧化能力均有顯著差異(P<0.05)，且總抗氧化能力均表現(xiàn)為111C>1>41C。在以蛋白胨為氮源的條件下，菌株1的總抗氧化能力顯著高于菌株111C和41C(P<0.05)。在以胰蛋白胨為氮源的條件下，菌株1、111C 的總抗氧化能力顯著高于菌株41C(P<0.05)。

不同氮源對(duì)3株內(nèi)生真菌菌株的總抗氧化能力均有明顯影響(P<0.05) (圖2)。菌株1的總抗氧化能力在不同氮源發(fā)酵液中有顯著差異(P<0.05)，在有酵母浸粉的發(fā)酵液中的總抗氧化能力顯著高于其他成分發(fā)酵液(P<0.05)，而在有尿素的發(fā)酵液中的總抗氧化能力顯著高于胰蛋白胨、氯化銨發(fā)酵液(P<0.05)。菌株41C的總抗氧化能力在不同氮源發(fā)酵液中有顯著差異(P<0.05)，在有酵母浸粉的發(fā)酵液中的總抗氧化能力顯著高于其他成分發(fā)酵液(P<0.05)，在有尿素、蛋白胨的發(fā)酵液中的總抗氧化能力顯著高于胰蛋白胨、氯化銨發(fā)酵液(P<0.05)，且在有胰蛋白胨、氯化銨的發(fā)酵液中的總抗氧化能力均差異顯著(P<0.05)。菌株111C的總抗氧化能力在不同氮源發(fā)酵液中均有顯著差異(P<0.05)，總抗氧化能力表現(xiàn)為酵母浸粉> 尿素> 胰蛋白胨 > 蛋白胨> 氯化銨。

圖2 不同氮源條件下Epichlo? sinensis菌株的發(fā)酵液的總抗氧化能力Figure 2 Total antioxidant capacities of fermented extracts of Epichlo? sinensis grown using different nitrogen sources

3 討論與結(jié)論

Epichlo?內(nèi)生真菌通過(guò)促進(jìn)宿主中華羊茅地上、地下生物量增加以及提高可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、植物激素含量等來(lái)增強(qiáng)中華羊茅逆境脅迫的抗性[14-17]。因此內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)和代謝在中華羊茅生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。碳氮源是內(nèi)生真菌生長(zhǎng)所需的最基本營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)其研究具有重要意義。Kulkarni 和Nielsen[28]研究發(fā)現(xiàn)在不同碳源及氮源條件下，高羊茅(Festuca arundinacea)內(nèi)生真菌的菌落直徑存在差異，該內(nèi)生真菌在以甘露醇為碳源、胰蛋白胨為氮源的條件下生長(zhǎng)的最好。Li 等[29]亦發(fā)現(xiàn)醉馬草(Achnatherum inebrians)內(nèi)生真菌對(duì)10種碳源和11種氮源的利用能力各不相同，其中蔗糖是最容易利用的碳源，酵母浸膏是最容易利用的氮源。本研究發(fā)現(xiàn)，碳源中菌株1和41C對(duì)葡萄糖的利用能力最強(qiáng)，111C對(duì)麥芽糖的利用能力最強(qiáng)；氮源中，3株E. sinensis菌株均對(duì)胰蛋白胨的利用能力最強(qiáng)。3株E. sinensis菌株在以尿素為氮源的發(fā)酵液上均不能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明E. sinensis基本上不能以尿素作為氮源。

內(nèi)生真菌有嚴(yán)格的寄主特異性，即同一種宿主植物中分離出的內(nèi)生真菌為同一種，但是從不同生態(tài)型宿主分離出的內(nèi)生真菌的形態(tài)特征以及生長(zhǎng)特性具有豐富的多樣性[12]。楊洋[19]從采自甘肅甘南的中華羊茅種子中分離出48株內(nèi)生真菌，在菌株培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)48株內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)速度、菌落特征和孢子形態(tài)存在差異。王美寧[21]對(duì)不同地理區(qū)域采集的中華羊茅種子中分離出的5株內(nèi)生真菌在添加維生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及金屬離子的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)從不同地理區(qū)域中華羊茅種子中分離出的內(nèi)生真菌菌株在每個(gè)處理?xiàng)l件下存在顯著差異。本研究選取從3個(gè)不同生態(tài)型中華羊茅種子中分離出的內(nèi)生真菌，以進(jìn)一步明確宿主生態(tài)型對(duì)E. sinensis最適碳氮源選擇的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 株E. sinensis在最適碳氮源的選擇上僅菌株111C 的最適碳源與其他菌株不同，說(shuō)明宿主生態(tài)型對(duì)E. sinensis最適碳氮源的選擇影響不大。

此外，內(nèi)生真菌是一種具有較大潛力的天然抗氧化劑。王夢(mèng)亮等[30]研究2株紅景天(Sedum rosea)內(nèi)生真菌的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)2株內(nèi)生真菌發(fā)酵物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子清除能力較強(qiáng)。劉雅莉等[31]研究21株蒺藜(Tribulus terrestris)內(nèi)生真菌的抗氧化與自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)21株內(nèi)生真菌的發(fā)酵物均具有一定的抗氧化作用。本研究結(jié)果表明，3株E.sinensis菌株均有一定的抗氧化能力，菌株111C的總抗氧化能力最強(qiáng)。在不同碳源條件下，不同菌株的總抗氧化能力差異不顯著，說(shuō)明碳源對(duì)E.sinensis的總抗氧化能力影響不大。在不同氮源條件下，不同菌株的總抗氧化能力亦有差異，3株內(nèi)生真菌均在以酵母浸粉為氮源的條件下，總抗氧化能力最強(qiáng)。而E. sinensis產(chǎn)生抗氧化能力的原因尚未明確，下一步應(yīng)致力于研究E. sinensis內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，探究其產(chǎn)生抗氧化能力的原因。