張韋鈺， 王春勇， 杜紅梅

(上海交通大學(xué)設(shè)計學(xué)院， 上海 200240)

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾屬多年生草本植物，喜歡濕潤冷涼的氣候，具有較強的抗寒能力，廣泛地分布于我國東北、華北、西北以及西南等地[6-7]。不同草地早熟禾品種的耐鹽性不同，‘Midnight II’是一個坪用性狀好，耐熱性強的草地早熟禾品種，適宜在我國華東地區(qū)栽培，但是耐鹽性較差[8]。我國江淮一帶有比較大的沿海灘涂面積，分析鹽脅迫對草地早熟禾的影響，采用一定的措施提高草地早熟禾品種的耐鹽性，并分析其機理對于草地早熟禾的推廣具有重要意義。

氫氣(H2)是宇宙中最輕、最充分的元素，一直以來被認(rèn)為是一種惰性氣體。但是近年來的研究表明，H2具有重要的生物學(xué)功能，可以提高植物對非生物脅迫的抗性[9]?，F(xiàn)有的研究表明，H2可以提高擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10]，甘薯(Dioscoreaesculenta)[11],水稻(Oryzasativa)[12-13],小白菜(Brassicacampestris)[14],玉米(Zeamays)幼苗[15]和黃瓜(Cucumissativus)幼苗[16]的耐鹽性。H2提高植物的抗鹽性和植物抗氧化能力的提高有關(guān)。趙蘋藝等的研究表明，H2提高甘薯幼苗的抗鹽性主要和幼苗中相對含水量(Relative water content,RWC)的增加和抗氧化能力的提高有關(guān)[11]；田婧蕓等證明了富氫水(Hydrogen-rich water,HRW)通過避免鹽脅迫下玉米幼苗的氧化應(yīng)激及重建活性氧穩(wěn)態(tài)來提高其耐鹽性[15]；Xu等也證明了H2增強水稻幼苗的耐鹽性和ROS代謝及其相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[13]。在以往對草地早熟禾耐鹽性影響的研究，多集中于不同品種耐鹽性的評價[17]、轉(zhuǎn)基因植株的研究[18]、外源添加物質(zhì)[19-20]以及生長調(diào)節(jié)劑[21]對草地早熟禾耐鹽性的影響等方面，而有關(guān)外源H2對草地早熟禾的耐鹽性及相關(guān)機制的影響的研究尚未見報道。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，在采用200 mM NaCl脅迫處理處理前以及脅迫處理前期，分別使用HRW對草地早熟禾進(jìn)行葉片噴施和灌根處理。通過比較非鹽處理以及鹽處理條件下，HRW對草地早熟禾葉片中相關(guān)生理指標(biāo)以及抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)等的影響，分析HRW對草地早熟禾耐鹽性的影響，并從抗氧化脅迫的角度，初步闡述HRW處理影響草地早熟禾耐鹽性的可能機制，本研究結(jié)果對草地早熟禾耐鹽性的提高，以及氫農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本次試驗草種為從北京克勞沃種子公司購買的進(jìn)口草地早熟禾品種‘Midnight II’。草種凈度為98%，發(fā)芽率為95%。

1.2 方法

1.2.1富氫水的制備 參考Cui等的方法[22]，將使用SHC-300型氫氣發(fā)生器(濟(jì)南浩偉儀器有限公司)制得的純凈氫氣(99.99%，v/v)以150 mL·min-1的速率通入1 L的去離子水中1 h，制得濃度為1.20 ppm的HRW。然后立即用去離子水進(jìn)行稀釋，制得體積濃度為50%的HRW。HRW濃度使用ENH-100便攜式測氫儀(Trustlex Co.,Led,Japan)測定。

1.2.2試驗處理 挑選大小一致，顆粒飽滿的草地早熟禾種子，5%的次氯酸鈉消毒15 min后，均勻地播種于4×8的穴盤中，每穴播種10粒種子，待穴盤種子萌發(fā)第二片葉后開始添加1/4的Hoagland’s營養(yǎng)液，35 d后開始進(jìn)行HRW處理。分為4種處理，分別是處理I：對照(Control，去離子水)，即只進(jìn)行去離子水的澆灌，不添加HRW與NaCl處理；處理II：50% HRW (去離子水+50% HRW)，使用50%的HRW對草地早熟禾進(jìn)行葉片噴施和灌根，保證葉片的正反兩面均勻噴施，灌根時充分灌溉，以有水從穴盤底部流出為準(zhǔn)，平均每株的施用量為大約10 mL，連續(xù)處理2 d，每天處理1次；處理III：200 mM NaCl，為了防止產(chǎn)生“鹽激”，NaCl濃度每天增加50 mM，至第4 d，達(dá)到200 mM；處理IV：200 mM NaCl+50% HRW，HRW在添加NaCl前2 d和前1 d各添加1次，添加NaCl 4 d后添加1次，添加方法同處理II及處理III。每個處理重復(fù)4次，每個處理16孔。鹽脅迫處理的0 d，5 d，15 d和20 d取樣進(jìn)行鹽脅迫指標(biāo)和活性氧代謝相關(guān)指標(biāo)分析。

4個組同時在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，氣候室內(nèi)溫度(23±2)℃/(18±2)℃(晝溫/夜溫)，相對濕度60%～80%，光周期10 h，光合有效輻射510 μmol·m-2·s-1。

1.2.4qRT-PCR 參照天根生化科技公司的RNAprep pure Plant Kit試劑盒進(jìn)行草地早熟禾總RNA的提取，然后依照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以合成的cDNA為模板，以Actin作為內(nèi)參基因，對草地早熟禾APX1，MR，CAT2基因進(jìn)行擴(kuò)增qRT-PCR按照TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行。參考轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行引物設(shè)計，引物序列詳見表1。

表1 草地早熟禾抗氧化酶相關(guān)基因引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件，在P<0.05的水平，采用Fisher’s最小顯著差異法，分析HRW對鹽脅迫條件下草地早熟禾耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)、ROS積累、抗氧化酶活性以及抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的影響。圖采用SigmaPlot 13.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 富氫水處理對草地早熟禾抗鹽相關(guān)生理指標(biāo)的影響

鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片的DMC(P<0.05)。而50%的HRW處理抑制了鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片的DMC積累，尤其是在長時間鹽脅迫條件下。在第5 d，10 d，15 d和20 d鹽脅迫條件下，添加50%的HRW處理后，草地早熟禾葉片的DMC分別下降了4.50%，5.30%，17.02%和28.42%(圖1-A)。

5 d～20 d的鹽脅迫均顯著降低了草地早熟禾葉片的RWC (P<0.05)。添加HRW抑制了鹽脅迫導(dǎo)致的草地早熟禾葉片失水。與不添加HRW的鹽脅迫處理相比，添加HRW處理10 d，15 d和20 d，草地早熟禾葉片的RWC分別增加了14.17%，35.54%和84.98%。而不加鹽的條件下，添加HRW對草地早熟禾葉片的RWC沒有顯著影響(圖1-B)。

圖1 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片干物質(zhì)含量(A)、相對含水量(B)的影響

與對照組相比，5 d和10 d鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片葉綠素含量無顯著變化，第15 d和第20 d顯著下降(P<0.05)。添加HRW延緩了由于鹽脅迫處理導(dǎo)致的草地早熟禾葉片的葉綠素降解。第15 d和20 d鹽脅迫條件下添加50%的HRW，草地早熟禾葉片中葉綠素含量顯著增加(P<0.05)，分別提高了49.32%和65.20%(圖2)。

圖2 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片葉綠素含量的影響

鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片的EL值(P<0.05)。與對照組相比，隨著鹽害程度的加深，草地早熟禾葉片的EL值逐漸增加(圖3)。50%的HRW處理顯著降低了鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片的EL值增加。在鹽處理的第5 d，10 d，15 d和20 d，添加50%HRW后，EL值分別下降了16.55%，18.24%，33.73%和25.08%。

圖3 50%富氫水處理對200 mM NaCl處理條件下草地早熟禾葉片電解質(zhì)外滲的影響

2.2 富氫水處理對鹽脅迫下草地早熟禾活性氧代謝的影響

圖4 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片超氧陰離子(A)和過氧化氫(B)含量的影響

MDA含量是衡量脅迫條件下植物細(xì)胞膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)。草地早熟禾葉片內(nèi)的MDA含量隨著鹽脅迫時間的延長而增加，在鹽脅迫的第5 d和20 d，相較于對照組，MDA含量分別增加了34.74%和122.51%；而外源添加HRW則顯著降低了鹽脅迫條件下草地早熟禾體內(nèi)MDA的積累(P<0.05)，相較于NaCl處理組，在第5 d和第20 d，HRW+NaCl組中草地早熟禾體內(nèi)的MDA含量分別降低了23.85%和26.22%(圖5)。

圖5 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片丙二醛含量的影響

鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片SOD活性(P<0.05)。而長時間鹽脅迫條件下，添加HRW則顯著降低了草地早熟禾葉片中SOD的活性(P<0.05) (圖6-A)。鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片POD活性(P<0.05) (圖6-B)。而外源添加50%濃度HRW，顯著抑制了草地早熟禾葉片中POD活性的增加，與不添加HRW處理的鹽處理相比，第5 d和20 d，POD活性分別降低了22.02%和23.30%。短時間的鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片CAT活性，而長時間的鹽脅迫顯著降低了草地早熟禾葉片CAT活性(P<0.05)。外源添加HRW抑制了長時間鹽脅迫下CAT活性的降低，與NaCl處理組相比，HRW+NaCl處理組中的CAT活性提高了36.51%(P<0.05) (圖6-C)。

圖6 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片超氧化物歧化酶(A)、過氧化物酶(B)和過氧化氫酶(C)活性的影響

鹽脅迫處理5 d沒有顯著影響草地早熟禾葉片APX活性。鹽脅迫處理20 d后，APX活性顯著下降(P<0.05)。外源添加HRW顯著增加了20 d鹽脅迫下草地早熟禾葉片中APX活性(圖7-A)。5 d和20 d的鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片的GR活性，尤其是在20 d鹽脅迫下。外源添加HRW顯著降低了20 d鹽脅迫下草地早熟禾葉片中GR的活性(圖7-B)。5 d和20 d的鹽脅迫顯著降低了草地早熟禾葉片的DR活性。外源添加HRW顯著提高了鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片中DR的活性，相較于鹽脅迫組，DR活性分別提高34.12%和58.22%(如圖7-C)。5 d鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片中的MR活性顯著增加，而20 d鹽脅迫條件下，草地早熟禾葉片中MR活性顯著下降。添加HRW抑制了鹽脅迫對草地早熟禾葉片MR活性的影響，20 d時差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，相較于NaCl處理組，HRW+NaCl處理組葉片中MR活性提高了52.93%(圖7-D)。

圖7 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片抗壞血酸過氧化物酶(A)、谷胱甘肽還原酶(B)、脫氫抗壞血酸還原酶(C)和單脫氫抗壞血酸還原酶(D)活性的影響

以草地早熟禾不添加NaCl和HRW對照條件下的基因表達(dá)量為1，對比其在5 d和20 d，50% HRW處理、200 mM NaCl處理以及200 mM NaCl+50%HRW處理條件下的抗氧化酶基因表達(dá)量，以此來分析HRW對鹽脅迫條件下草地早熟禾抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的影響。在5 d和20 d鹽脅迫條件下，與對照相比，草地早熟禾葉片內(nèi)3個抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR均上調(diào)表達(dá)，外源施加50% HRW不同程度的降低了鹽脅迫條件下相關(guān)基因的表達(dá)量(圖8)。在鹽脅迫的第5 d和20 d，草地早熟禾葉片中CAT2，APX1和MR的相對表達(dá)量分別是對照組的1.67倍和1.71倍，1.48倍和2.54倍以及2.38倍和1.79倍；而外源添加50%的HRW分別使鹽脅迫下CAT2，APX1和MR的相對表達(dá)量降低了27.53%和24.56%，40.6%和35.21%以及21.73%和31.17%。

圖8 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片CAT2 (A)，APX1 (B)和MR (C)相對表達(dá)量的影響

3 討論與結(jié)論

采用一定的措施提高草坪草的耐鹽性，并分析其相關(guān)機制，是草坪草應(yīng)用和新品種選育過程中的難點。鹽害影響植物的光合作用以及水分的吸收和利用[30]。草地早熟禾在鹽脅迫，尤其是長時間鹽脅迫條件下葉片的RWC含量下降，DMC含量增加，外源添加HRW處理后，鹽脅迫下草地早熟禾葉片RWC含量上升，DMC含量下降，這可能是由于草地早熟禾在鹽脅迫下，細(xì)胞失水導(dǎo)致RWC含量下降，DMC含量上升，而添加HRW降低了細(xì)胞的失水率，提高了細(xì)胞的RWC，也在一定程度上導(dǎo)致了DMC含量下降現(xiàn)象的發(fā)生。

鹽脅迫條件下葉片衰老的重要原因是葉綠素含量下降[31]，葉綠素含量的高低與葉片的光合能力密切相關(guān)。鹽脅迫條件下添加HRW，尤其是在15 d和20 d鹽脅迫條件下，與NaCl處理組相比，HRW+NaCl處理組的葉綠素含量維持在較高水平，這說明HRW能夠有效維持鹽脅迫下草地早熟禾體內(nèi)的葉綠素含量，維持植物光合作用的正常進(jìn)行。細(xì)胞失水會引起細(xì)胞內(nèi)膨壓和滲透勢的改變，造成電解質(zhì)外滲率的增加[32]。植物在鹽脅迫條件下會發(fā)生膜透性增強和膜脂過氧化現(xiàn)象。作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA會損害細(xì)胞生物膜并抑制保護(hù)酶的活性[33]。在本研究中，鹽脅迫條件下，草地早熟禾葉片EL值上升，MDA含量增加，外源添加HRW降低了鹽脅迫下葉片的EL，減少了葉片MDA的積累，這說明外源添加HRW降低了鹽脅迫條件下草地早熟禾細(xì)胞膜的損傷。

高濃度的ROS對植物的生長是有害的。鹽脅迫條件下，光合作用受到抑制，ROS的合成增加，植物體內(nèi)的氧化還原過程失衡，引起氧化損傷，破壞植物體內(nèi)的生物大分子[36]。此時，抗氧化酶活性提高，用于清除過量的ROS[31],和Puyang等的研究一致，在一定時間鹽脅迫條件下，草地早熟禾ROS清除酶活性增加[34]。與鹽處理的對照相比，HRW處理后ROS積累量顯著下降，因此相關(guān)ROS清除酶的活性也顯著低于僅用鹽處理的植株。另外，和Xu等[13]在水稻鹽脅迫以及Cui等[22]在苜蓿(Medicagosativa)鎘脅迫中的發(fā)現(xiàn)一樣，也發(fā)現(xiàn)了重度鹽脅迫條件下，草地早熟禾中部分抗氧化酶，包括CAT，APX，DR和MR活性顯著下降，而在HRW處理條件下，這些抗氧化酶的活性顯著增加，從而有效降低鹽脅迫損傷，減少細(xì)胞的過氧化程度，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。

植物鹽脅迫條件下，通過相關(guān)酶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)抗氧化酶蛋白的表達(dá)，從而使植物表現(xiàn)出一定的抗鹽能力。在本研究中，在鹽脅迫條件下，與0 d以及5 d和20 d非鹽脅迫的對照相比，草地早熟禾抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR都上調(diào)表達(dá)，可能是植物對于ROS積累的一種響應(yīng)。Xie等[10]在鹽處理5 d的擬南芥植株中發(fā)現(xiàn)了H2阻遏了由鹽脅迫導(dǎo)致的cAPX1的下調(diào)表達(dá)，而Xu等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，水稻鹽處理3 d，添加HRW有利于APXb和CATB基因的上調(diào)表達(dá)，提高相關(guān)抗氧化酶的活性，緩解水稻的鹽脅迫。與前人的研究不同的是，添加HRW后，草地早熟禾3個抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR的表達(dá)量都顯著的低于鹽脅迫處理，這一方面可能是由于受脅迫強度的影響，另一方面是由于添加HRW處理后，ROS含量顯著下降，反饋調(diào)控了抗氧化酶基因的上調(diào)表達(dá)。

基于以上分析，并結(jié)合鹽脅迫下草地早熟禾的各項生理指標(biāo)可知，50% HRW處理能夠有效提高草地早熟禾的耐鹽性，緩解鹽脅迫帶來的氧化損傷，基于此推測在植物逆境脅迫中，HRW可能有直接清除ROS的能力，而這一觀點已經(jīng)在動物試驗中得到了證實。Ohsawa等[37]以及Ohta[38]的研究均表明，H2可以選擇性的清除生物體內(nèi)的過量自由基，同時不會與其它必要的ROS發(fā)生反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗氧化的作用。此外，在體外試驗中，也進(jìn)一步證實了HRW有直接淬滅H2O2的作用[10]。與沈文飚等[9]的推測一樣，本研究認(rèn)為在H2調(diào)控草地早熟禾鹽脅迫過程中，ROS的含量變化可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。外源H2添加的情況下，草地早熟禾鹽脅迫下ROS的重要作用可以總結(jié)為圖9。

圖9 活性氧在外源H2調(diào)控草地早熟禾耐鹽性中的重要作用

綜上所述，外源添加HRW顯著提高草地早熟禾的耐鹽性，可能與HRW通過降低ROS積累，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，避免氧化應(yīng)激，重構(gòu)活性氧穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞的抗氧化能力有關(guān)。