葉 剛， 張笑笑， 陳靜波， 李建建， 李 玲， 劉建秀， 郭愛桂， 郭海林

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014)

結(jié)縷草屬(Zoysia)植物是當(dāng)前廣泛使用的優(yōu)良暖季型草坪草之一，主要分布于非洲、亞洲和大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。結(jié)縷草屬植物有11個(gè)種，以及若干變種和變型，各個(gè)種在形態(tài)、生理、遺傳等各方面存在著豐富的變異，這些豐富的遺傳資源為雜交育種及性狀改良奠定了重要的基礎(chǔ)。該草種可適應(yīng)不同類型的土壤環(huán)境，因其具有特定的低維護(hù)、耐踐踏、抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄、抗病蟲害等特性，正日益引起國(guó)內(nèi)外草坪草育種家和相關(guān)研究者的關(guān)注[2-5]，已廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪、綠地草坪及水土保持草坪等。我國(guó)是結(jié)縷草屬植物分布最豐富、儲(chǔ)量最大的國(guó)家[6]，但由于我國(guó)對(duì)草坪草的研究起步較晚，至今培育的新品種非常少，不能完全適應(yīng)我國(guó)地域遼闊、氣候類型多樣的環(huán)境。

雜交育種作為一種傳統(tǒng)的重要育種方式，可為優(yōu)良品種的選育提供更多機(jī)會(huì)，被植物育種家廣泛應(yīng)用。江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所自2000年就開始了結(jié)縷草屬植物的雜交育種工作，并根據(jù)結(jié)縷草雌蕊先熟，雄蕊后熟的開花習(xí)性，采用不去雄的控制授粉雜交方法，但結(jié)縷草屬植物雌蕊和雄蕊的開花次序均為從花序頂部到基部依次開花，部分結(jié)縷草頂部的花藥開裂時(shí)，基部的雌蕊還未萎蔫，導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生部分自交后代，自交結(jié)實(shí)率變異范圍為0～54%，平均為16.15%[7]，因此采用不去雄的方法進(jìn)行雜交育種就必須對(duì)雜交后代的真實(shí)性進(jìn)行鑒定。

形態(tài)學(xué)鑒定是最直接、最基礎(chǔ)的鑒定方法。結(jié)縷草屬的雜交后代主要通過生殖性狀和營(yíng)養(yǎng)性狀等外部性狀來鑒別，生殖性狀包括生殖枝高度，穗軸長(zhǎng)度，花序長(zhǎng)度與寬度，小穗長(zhǎng)度和寬度等性狀；營(yíng)養(yǎng)性狀包括葉片長(zhǎng)度和寬度，節(jié)間長(zhǎng)度和直徑，草層高度、密度等。郭海林[8]的研究表明通過對(duì)這些外部性狀的調(diào)查和測(cè)量，可以初步鑒定出結(jié)縷草屬雜交后代的真實(shí)性。只是形態(tài)學(xué)特征容易受環(huán)境條件以及人為因素的影響，不能真實(shí)、準(zhǔn)確地反應(yīng)其后代的遺傳變異，因而需要借助其他技術(shù)手段進(jìn)行輔助鑒定與驗(yàn)證。分子標(biāo)記是指可以顯示染色體及其片段、基因或某一特定DNA序列在系譜中的傳遞軌跡的易于檢測(cè)的遺傳物質(zhì)，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映，受外界環(huán)境影響較小，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位、分子標(biāo)記輔助育種、植物種質(zhì)鑒定等諸多領(lǐng)域，并發(fā)揮著重大的作用[9-12]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)分子標(biāo)記是基于PCR技術(shù)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，由Li與Quiros于2001年首先開發(fā)出來，該標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果穩(wěn)定、便于克隆測(cè)序目標(biāo)片段以及成本較低等特點(diǎn)。本課題組在前期工作中建立了結(jié)縷草SRAP-PCR優(yōu)化體系[13]，并將其應(yīng)用于結(jié)縷草屬植物的雜種真實(shí)性鑒定[14]、遺傳多樣性研究[15]和遺傳圖譜構(gòu)建中[16]，這些研究表明，SRAP分子標(biāo)記在結(jié)縷草屬植物研究中具有穩(wěn)定性好，檢出效率高的特點(diǎn)。鑒于此，本研究將在前期工作的基礎(chǔ)上，采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SRAP標(biāo)記技術(shù)2種方法同時(shí)對(duì)結(jié)縷草屬19個(gè)雜交組合的34份雜交后代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，從而使試驗(yàn)結(jié)果更具有說服力，也為下一步的后代選育及其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為結(jié)縷草屬19個(gè)雜交組合的27個(gè)親本及其34個(gè)雜交后代，34個(gè)雜交后代分別于2002年和2004年通過人工控制授粉法雜交獲得，目前均種植于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所苗圃(118°28′ E，32°02′ N，海拔30～40 m)。親本來源、雜交組合和雜交后代信息詳見表1和表2。

表1 結(jié)縷草屬雜交組合的親本

續(xù)表1

表2 結(jié)縷草屬雜交組合及其后代

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外部形態(tài)鑒定 測(cè)量指標(biāo)：2019年6—7月對(duì)27個(gè)親本及其34個(gè)后代材料的10個(gè)形態(tài)指標(biāo)(包括草層高度、密度，葉片長(zhǎng)度和寬度，匍匐莖節(jié)間長(zhǎng)度和直徑，匍匐莖色澤，葉片上下表面茸毛密度和葉舌纖毛密度)進(jìn)行觀測(cè)，并對(duì)不同組合的后代形態(tài)特征與親本進(jìn)行比較和方差分析，以初步判斷34個(gè)雜種的真實(shí)性及其與親本相比的差異性。

測(cè)量方法采用郭海林等[8]和周志芳等[17]的方法。

草層高度：指結(jié)縷草生長(zhǎng)的自然高度，采用五點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)量。

密度：指每100 cm2內(nèi)直立枝的數(shù)目，重復(fù)測(cè)量3次。

葉片長(zhǎng)度和寬度：指直立枝上倒3葉完全展開葉的長(zhǎng)度和葉片中部寬度，重復(fù)測(cè)量10次。

匍匐莖節(jié)間長(zhǎng)度和直徑：隨機(jī)選取健康生長(zhǎng)的匍匐莖，測(cè)量倒4節(jié)的長(zhǎng)度和中部位置的直徑，重復(fù)測(cè)量10次。

匍匐莖色澤：采用5級(jí)制，綠色為1，黃褐為2，褐色為3，淺紫為4，深紫為5。

葉片上/下表面茸毛密度：目測(cè)葉片上/下表面茸毛狀況，無或極疏為1，疏為2，密為3。

葉舌纖毛密度：目測(cè)葉片葉舌纖毛狀況，無或極疏為1，疏為2，密為3。

數(shù)據(jù)處理和分析：每個(gè)參試材料測(cè)試的形態(tài)指標(biāo)平均數(shù)用Excel 2019軟件進(jìn)行計(jì)算，并利用SPSS 26.0軟件對(duì)每一組合的親本和后代的每個(gè)形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，從而比較雜交后代和親本之間的關(guān)系，判斷其真實(shí)性。

1.2.2分子標(biāo)記鑒定 雜交后代及其親本基因組DNA的提取和檢測(cè)：雜交后代及其親本基因組DNA的提取和檢測(cè)，采用薛丹丹等[13]和郭海林等[18]的方法。

SRAP引物組合：SRAP引物設(shè)計(jì)參考Li和Quiros的方法[19]。根據(jù)SRAP-PCR反應(yīng)體系，隨機(jī)選取7條正向引物和10條反向引物[20，21]，共組合成70對(duì)SRAP引物，用于后代的真實(shí)性鑒定，其序列見表3。

表3 SRAP引物序列

SRAP-PCR擴(kuò)增程序及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：應(yīng)用雜交親本材料對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，從中獲得具有擴(kuò)增條帶清晰、豐富的父本特征性條帶的引物組合，用于雜交后代的真實(shí)性鑒定，每一個(gè)引物組合重復(fù)試驗(yàn)一次。

SRAP-PCR擴(kuò)增體系為：總體積10 μL，PCR Mix 5.0 μL，2 mmol·L-1引物1.0 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 2.5 μL，PCR Mix購自南京博彩生物科技有限公司，DNA Marker購自南京TaKaRa公司。

SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在TC-412型擴(kuò)增儀(TECHN公司,英國(guó))中進(jìn)行。

擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL 6×Loading buffer混勻，上樣于10%的聚丙烯酰胺凝膠，用240 V電壓進(jìn)行電泳分離約2.0 h(DYY-8B型電泳儀,JY-SCZ6型電泳槽,北京六一)，然后在搖床上進(jìn)行銀染檢測(cè)，并拍照記錄。

雜交后代真實(shí)性鑒定：應(yīng)用表3中引物組合，以清晰穩(wěn)定的父本特征帶為判斷依據(jù)，分別對(duì)各雜交組合進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，后代擴(kuò)增結(jié)果中具有父本相對(duì)于母本的特異型帶的即為真雜種，而只具有母本特異條帶無父本特征帶的后代則為假雜種或自交種。每一特征引物組合重復(fù)試驗(yàn)一次，此外還同時(shí)用多個(gè)引物進(jìn)行鑒定，最后依據(jù)父本特征帶對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交后代的外部形態(tài)鑒定

通過對(duì)結(jié)縷草屬植物19個(gè)雜交組合的親本及其雜交后代的10個(gè)外部性狀進(jìn)行觀測(cè)，并對(duì)同一組合的后代與親本觀測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表4和5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一組合的不同后代在10個(gè)外部性狀上存在不同程度的差異，且大部分雜交后代的外部性狀與母本或雙親都存在顯著性差異。對(duì)34個(gè)后代的變異和鑒定情況分析如表6所示。由表6可知，根據(jù)形態(tài)特征，34個(gè)后代中除了0402-6，0402-8，0404-4，0404-5因有6個(gè)或6個(gè)以上的外部性狀都與母本無顯著性差異可能為假雜種，其余30個(gè)雜交后代觀測(cè)的10個(gè)外部性狀中至少有5個(gè)外部性狀與母本存在顯著差異，因此初步判斷它們?yōu)檎骐s種。

表4 19個(gè)雜交組合的外部性狀多重比較及變異分析

續(xù)表4

續(xù)表4

表5 19個(gè)雜交組合的形態(tài)指標(biāo)變異范圍分析

表6 34個(gè)后代的外部性狀多重比較及變異分析

續(xù)表6

2.2 雜交后代的SRAP分子標(biāo)記鑒定

以70對(duì)SRAP引物對(duì)19個(gè)雜交組合的雜種真實(shí)性從分子標(biāo)記的角度進(jìn)行鑒定，以父本相對(duì)于母本的清晰的特征帶為判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70對(duì)引物中可以用16對(duì)引物將34個(gè)后代鑒定為真雜種。

首先用引物組合Me1Em1和Me1Em2對(duì)全部19個(gè)雜交組合的后代進(jìn)行鑒定，結(jié)果0204，0210，0217，0233，0404等5個(gè)雜交組合的全部后代在引物Me1Em1中都擴(kuò)增出各自的父本特征條帶，均被鑒定為真雜種，0232，0233，0238等3個(gè)雜交組合的后代用引物Me1Em2鑒定為真雜種；然后用引物組合Me1Em3，Me1Em4，Me1Em5，Me1Em6對(duì)余下的12個(gè)雜交組合進(jìn)行鑒定，結(jié)果引物Me1Em5將0228雜交組合的后代0228-4鑒定為真雜種，引物Me1Em6將0237雜交組合的兩個(gè)后代鑒定為真雜種；緊接著用Me1Em 7，Me1Em8，Me1Em9等5對(duì)引物組合對(duì)余下的10個(gè)雜交組合進(jìn)行鑒定，引物Me1Em9在0402，0410，0201，0202，0204，0221，0232，0234，0236，0419共10個(gè)組合的父本中擴(kuò)增出了特異性條帶，其中0201，0221，0234，0419四個(gè)雜交組合的全部后代都擴(kuò)增出父本特征條帶，被鑒定為真雜種，引物Me1Em7和Me1Em8將0207和0412這2個(gè)雜交組合的后代鑒定為真雜種；又用Me5Em9，Me5Em10，Me6Em1，Me6Em2等10對(duì)引物組合對(duì)余下4個(gè)雜交組合進(jìn)行鑒定，結(jié)果Me5Em9，Me5Em10，Me6Em1，Me6Em3，Me6Em6，Me6Em7等6對(duì)引物均可以將0202雜交組合的4個(gè)后代鑒定為真雜種，而0236雜交組合的3個(gè)后代中只有2個(gè)后代0236-7，0236-8被Me5Em9和Me6Em1兩對(duì)引物鑒定為真雜種，0402雜交組合則用Me5Em9和Me6Em2兩對(duì)引物鑒定為真雜種；最后用Me7Em1，Me7Em2，Me7Em3等10對(duì)引物組合對(duì)余下2個(gè)雜交后代0236-4，0410-3進(jìn)行鑒定，結(jié)果在引物Me7Em5中兩個(gè)后代材料均擴(kuò)增出各自的父本特征條帶，鑒定為真雜種。據(jù)此，34個(gè)雜交后代全部鑒定為真雜種。如圖1，以引物Me1Em9對(duì)其中10個(gè)雜交組合后代的鑒定結(jié)果為例。對(duì)所有親本雜交組合的后代雜種鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表7。

圖1 Me1Em9對(duì)其中10個(gè)雜交組合后代的鑒定結(jié)果

表7 雜種鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 形態(tài)特征鑒定

形態(tài)學(xué)標(biāo)記因其具有快速、簡(jiǎn)便，無需昂貴的儀器設(shè)備等特點(diǎn)，成為育種者們進(jìn)行雜種鑒定和遺傳多樣性研究的重要手段，在蕓薹屬、菊屬、辣椒屬、月季、小麥[22-26]等植物中都有較多的報(bào)道。本研究通過對(duì)親本和后代的外部性狀觀測(cè)值進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組合的親本和后代之間均存在不同程度的差異，且同一組合不同后代的外部性狀之間也有較大變異，說明通過雜交育種使結(jié)縷草屬植物后代產(chǎn)生了基因重組現(xiàn)象，從而導(dǎo)致后代間發(fā)生了豐富的變異，進(jìn)一步為新品種的選育工作提供了基礎(chǔ)。由親本和后代的變異范圍可知，不同組合雜交后代的10個(gè)外部性狀變異范圍存在較大的差異，后代變異范圍超出親本的最高達(dá)到80%，最小只有20%。利用10個(gè)營(yíng)養(yǎng)性狀指標(biāo)對(duì)結(jié)縷草屬植物19個(gè)組合27個(gè)親本和34個(gè)后代的變異情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有30個(gè)雜交后代的多個(gè)外部性狀均與父母本存在顯著差異，初步判斷它們?yōu)檎骐s種，而另外4個(gè)后代0402-6，0402-8，0404-4和0404-5分別有6個(gè)或6個(gè)以上的外部性狀與母本無顯著性差異，從外部性狀上不能確定其為真雜種，必須借助于分子標(biāo)記等技術(shù)手段對(duì)其作進(jìn)一步的鑒定。

3.2 分子標(biāo)記鑒定

隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在各個(gè)研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[8-11]。與形態(tài)學(xué)鑒定相比較，分子標(biāo)記技術(shù)不受植物正常生理代謝及環(huán)境變化的影響，能從遺傳物質(zhì)DNA水平研究植物基因的變化，操作更簡(jiǎn)單，結(jié)果更精確[25]。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)具有引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，通用性高等優(yōu)良特性，已被廣泛應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因定位、植物種質(zhì)鑒定和分子標(biāo)記輔助育種中，并已在假儉草[27]、海雀稗[28]、狗牙根[29-30]等草坪草的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、新品系鑒定等研究中發(fā)揮了重要作用。本文應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自于19個(gè)雜交組合的34個(gè)后代進(jìn)行雜種鑒定，結(jié)果表明，全部后代因具有父本的特征帶而被鑒定為真雜種。同時(shí)，從雜種擴(kuò)增的條帶看，雜種譜帶并不是雙親譜帶之和，而是出現(xiàn)了新譜帶的增加或某些譜帶的消失，同一雜交組合中的后代在相同的引物下擴(kuò)增的條帶也不一致，另外，本研究利用不同的SRAP引物對(duì)同一組合的后代進(jìn)行多次鑒定獲得了更準(zhǔn)確的結(jié)果。這些結(jié)果均表明結(jié)縷草屬植物通過雜交育種導(dǎo)致了后代的基因重組，并產(chǎn)生了豐富的變異，這都為雜交后代的選育工作提供了依據(jù)。同時(shí)雜交后代真實(shí)性的鑒定也為進(jìn)一步選育優(yōu)良雜交后代奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文通過形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記兩種鑒定手段對(duì)結(jié)縷草屬植物19個(gè)雜交組合的34個(gè)后代雜種真實(shí)性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，形態(tài)學(xué)鑒定中有30個(gè)后代因其在測(cè)定的外部性狀上與父本無顯著差異而與母本有顯著差異，因此初步推斷其可能為真雜種，而另外4個(gè)后代因在外部性狀上與母本差異不顯著或僅有少數(shù)性狀與母本有差異，不能確定其是否為真雜種，進(jìn)而通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定其雜種的真實(shí)性，兩種方法的有效結(jié)合，最終將34個(gè)雜交后代全部鑒定為真雜種，為后續(xù)研究和新品種選育奠定了良好的基礎(chǔ)。