陳廣英，馬俊勛，胡毅

0 引言

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中肺腺癌是主要的病理類型，因此對于肺腺癌的精準治療一直是臨床研究的熱點，目前肺腺癌的治療，已經(jīng)從化療、靶向治療的模式，轉(zhuǎn)向以PD-1單抗為代表的免疫治療模式；然而，基于PD-L1表達水平、腫瘤突變負荷等療效預測標志物指導下的肺腺癌的免疫治療[1-3]，并不能完全預測肺腺癌免疫治療的療效，所以探索肺腺癌新的免疫治療療效預測標志物值得深入研究。

前期研究顯示，基于二代測序技術的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與肺癌免疫治療療效預測的相關基因，Dong等研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中突變頻率較高的KRAS聯(lián)合TP53共突變可以預測腫瘤免疫治療療效[4]；但是隨著二代測序技術的發(fā)展，同樣發(fā)現(xiàn)了一些在肺腺癌突變頻率比較低的基因，而對于突變頻率相對較低的DNA修復相關基因（DNA repair genes,DRGs）如果發(fā)生相應的突變，同樣可能導致新生抗原及更高的腫瘤突變負荷（tumor mutational burden,TMB），或許也可以預測免疫治療反應。如何分析這些少見基因的突變檢測結果，從而更加精準指導肺腺癌的免疫治療具有重要意義。本研究基于此出發(fā)點，進一步探索突變頻率相對較低的DRGs基因突變及其共突變在肺腺癌免疫治療療效中的預測價值。

1 資料與方法

1.1 肺腺癌基因突變數(shù)據(jù)集篩選和獲取

基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫檢索肺腺癌與免疫治療相關數(shù)據(jù)集，按照納入/排除標準進行篩選。其中納入標準：（1）病理診斷為肺腺癌患者；（2）接受免疫單藥治療的患者；（3）臨床資料和基因突變數(shù)據(jù)完整；（4）基于二代測序技術分析突變特征。排除標準：（1）病理類型為肺鱗癌或未分類非小細胞肺癌；（2）接受免疫聯(lián)合化療或者免疫聯(lián)合抗血管生成治療。

本研究從cBioPortal公共數(shù)據(jù)庫中納入兩項肺腺癌免疫治療研究：包括TMB and Immunotherapy（MSKCC,Nat Genet 2019）中271例肺腺癌患者和Non-Small Cell Lung Cancer（MSK,Cancer Cell 2018）中59例肺腺癌患者。這兩項獨立研究分別作為測試集和驗證集。同時，分別下載基因突變數(shù)據(jù)集和臨床特征數(shù)據(jù)集進行后續(xù)研究。

1.2 肺腺癌腫瘤突變負荷和總生存關系分析

基于腫瘤突變負荷評分和肺腺癌的生存期關系，分析和比較不同腫瘤突變負荷與肺腺癌總生存的關系。

1.3 肺腺癌患者KRAS、TP53和DRGs突變特征分析

本研究以KRAS/TP53共突變作為療效預測陽性對照，選擇DRGs中BRCA1、BRCA2、POLE、POLD1進行研究?；跍y試集271例肺腺癌患者突變特征譜，對這些DRGs基因進行基因突變頻率譜特征分析。

1.4 肺腺癌患者KRAS/TP53共突變、DRGs突變及其共突變與腫瘤突變負荷的關系分析

基于測試集首先比較DRGs突變組與KRAS/TP53共突變組在腫瘤突變數(shù)量、腫瘤突變負荷等方面的差異。其次，為了探索DRGs聯(lián)合KRAS或者TP53共突變，能否更好預測腫瘤突變負荷，本研究進一步分析并比較DRGs與KRAS或者TP53的共突變，對于預測腫瘤突變數(shù)量、腫瘤突變負荷的效能問題。最后，比較DRGs聯(lián)合KRAS或者TP53共突變組與KRAS/TP53共突變組在腫瘤突變數(shù)量、腫瘤突變負荷等方面的差異。

1.5 驗證集分析KRAS/TP53共突變、DRGs突變及其共突變與肺腺癌免疫治療療效的關系

基于驗證集59例肺腺癌患者，進一步驗證DRGs突變及其聯(lián)合KRAS或者TP53共突變在預測腫瘤突變負荷、腫瘤新生抗原及免疫治療無進展生存期等方面的差異。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同突變負荷狀態(tài)基線特征及其與總生存的關系

以腫瘤突變負荷評分15為閾值，分成低突變負荷組和高突變負荷組，結果顯示，兩組患者在年齡、性別方面未見統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），見表1；但高突變負荷組具有更長的生存期，且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），見圖1。

圖1 腫瘤突變負荷與肺腺癌患者總生存之間的關系Figure 1 Relation between tumor mutation burden and overall survival of lung adenocarcinoma patients

表1 高突變負荷組和低突變負荷組肺腺癌患者的基線特征Table 1 Baseline characteristics of lung adenocarcinoma patients in high-and low-tumor mutation burden(TMB) groups

2.2 肺腺癌患者KRAS/TP53和DNA修復相關基因突變特征

結果顯示，相對于KRAS（40%）和TP53（58%）突變比例較高而言，DRGs的突變頻率相對較低，分別為BRCA1（4%）、BRCA2（4%）、POLE（5%）和POLD1（0.9%），見圖2。

圖2 肺腺癌患者中KRAS、TP53和DNA修復相關基因突變特征譜Figure 2 Characteristic spectrum of KRAS,TP53 and DNA repair related genes mutation in lung adenocarcinoma patients

2.3 肺腺癌患者KRAS/TP53共突變、DRGs突變及其共突變與腫瘤突變負荷的關系

結果顯示，以KRAS/TP53共突變?yōu)殛栃詫φ?，DRGs基因突變組顯示出較低的基因突變數(shù)量（10.94±0.98vs.3.00±0.00）和腫瘤突變負荷（10.34±0.95vs.2.79±0.16），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.069,P=0.072），見圖3A～B。

在進一步探索DRGs聯(lián)合KRAS或TP53共突變，能否更好地預測腫瘤突變負荷方面，結果顯示，KRAS/DRGs共突變組，相對于KRAS突變組和DRGs突變組，具有更高的腫瘤突變數(shù)量（9.00±2.45vs.7.90±0.54vs.3.00±0.00）和腫瘤突變負荷（9.15±2.43vs.7.94±0.58vs.2.79±0.16），但差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.688,0.178和P=0.633,0.156），見圖3C～D；然而在TP53/DRGs共突變組，相對于TP53突變組和DRGs突變組來說，具有更高的腫瘤突變數(shù)量（29.36±7.63vs.10.37±0.96vs.3.00±0.00）和腫瘤突變負荷（29.78±8.44vs.10.36±0.96vs.2.79±0.16），且差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.0033,0.006和P=0.0045,0.010），見圖3E～F；而且TP53/DRGs共突變組，相比陽性對照KRAS/TP53共突變組，具有更高的腫瘤突變數(shù)量（29.36±7.63vs.10.94±0.98）和腫瘤突變負荷（29.78±8.44vs.10.34±0.95），且兩組之間差異亦有統(tǒng)計學意義（P=0.037,P=0.044），見圖3G～H。

圖3 肺腺癌患者中KRAS、TP53、DRGs突變與KRA/TP53、TP53/DRGs共突變在基因突變數(shù)量和腫瘤突變負荷方面的比較Figure 3 Comparison of gene mutation count and tumor mutation burden between only KRAS or TP53 or DRGs mutation groups and KRAS/TP53 or TP53/DRGs co-mutation groups of lung adenocarcinoma patients

2.4 驗證集分析KRAS/TP53共突變、DRGs突變及其共突變與肺腺癌免疫治療療效的關系

結果顯示，在驗證集中，相比于TP53突變組、DRGs突變組和Kras/TP53共突變組來說，TP53/DRGs共突變組不僅具有更高的非同源突變負荷（392.69±118.21、71.50±17.50、491.60±129.35、645.40±200.70），而且具有更高的腫瘤新生抗原（921.15±262.14、248.50±123.50、1264.80±338.77、1707.60±708.25），見圖4A～B。在無進展生存時間方面，相比KRAS/TP53共突變組（14.99±3.75）、DRGs突變組（18.64±5.31）和TP53突變組（7.36±1.99），TP53/DRGs共突變組（21.87±3.63）具有更長的無進展生存期，見圖4C。

圖4 單純TP53或DRGs突變與KRAS/TP53、TP53/DRGs共突變組在肺腺癌腫瘤新生抗原(A)、非同源腫瘤突變負荷(B)以及無進展生存期(C)的比較Figure 4 Comparison of tumor neoantigens burden(A),tumor nonsynonymous mutation burden(B) and progressionfree survival(C) between only TP53 or DRGs mutation groups and KRAS/TP53 or TP53/DRGs co-mutation groups of lung adenocarcinoma patients

3 討論

近年來，隨著肺腺癌免疫治療研究的深入，以PD-1為代表的的免疫治療在肺腺癌中顯示出卓越的療效[5]，但是免疫治療并非對所有的肺腺癌患者都有效。目前NCCN指南和CSCO共識中，基于PD-L1表達水平來預測肺腺癌的免疫治療療效問題，但是限于PD-L1表達情況為免疫組織化學檢測方法，受到檢測抗體和平臺等差異的影響，PD-L1表達結果往往具有不一致性，所以目前按照PD-L1表達來篩選免疫治療獲益人群存在一定的局限性[6-7]。如何更加精準地探索免疫治療獲益人群，對于肺腺癌的個體化免疫治療來說顯得尤為重要。本研究正是基于此，依靠二代測序技術的發(fā)展，探索DRGs及其基因共突變在肺腺癌免疫治療中的價值及其預測作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，更高的腫瘤突變負荷在肺腺癌中顯示出更長的總生存期，提示腫瘤突變負荷對于總生存期具有重要影響，同時在患者基線特征方面，研究顯示，對于伴有肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等肺腺癌患者，可能具有較低的腫瘤突變負荷，與既往的研究結果一致；Shiroyama等[8]亦研究了三個日本中心接受Nivolumab治療晚期非小細胞肺癌的201例患者，結果顯示，肝轉(zhuǎn)移肺癌患者與較短的無進展生存和較低的免疫治療反應率密切相關，與我們的研究結果一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在胸膜轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移的患者中，也往往具有較低的腫瘤突變負荷，提示在臨床工作中，對于伴有肝臟、顱腦、骨等轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者，可能具有較低的腫瘤突變負荷，應用免疫治療有效率偏低。綜合分析這些研究結論，在臨床診療中，基于患者臨床特征的分析，或許有助于篩選免疫治療可能有效的人群。

本研究的重要發(fā)現(xiàn)之一在于，相對于KRAS/TP53共突變組，雖然DRGs突變組具有相對較低腫瘤突變負荷，但是兩組之間并沒有顯著性差異，提示DRGs突變可以在一定程度上預測肺腺癌患者的腫瘤突變負荷和免疫治療的療效。Yao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在中國人群中，基于POLE和POLD1基因突變檢測，或許可以預測免疫治療的療效問題，與我們的研究結果一致；但Yao等的研究，僅僅選取了DRGs中POLE和POLD1基因，而其他的DRGs基因，如BRCA1、BRCA2等未納入研究。本研究不僅納入了BRCA1和BRCA2基因，彌補了前期研究的不足，還研究了DRGs與其他基因共突變問題，更能反應DRGs突變及其共突變在肺腺癌免疫治療中的預測價值。DRGs基因突變可能影響免疫治療療效的可能機制在于，DRGs在DNA的損傷修復中扮演重要的角色，而DRGs基因發(fā)生突變后，可能產(chǎn)生新的抗原，從而導致更高的腫瘤突變負荷和更好的免疫治療療效。

為了進一步優(yōu)化DRGs突變及其共突變在預測免疫治療療效的效能，本研究的另一個重要發(fā)現(xiàn)在于，在TP53/DRGs共突變中，顯示出更高的腫瘤突變負荷和新生抗原形成，提示TP53/DRGs共突變肺腺癌患者具有更好的免疫治療反應，但是，KRAS/DRGs共突變并不能預測肺腺癌免疫治療的反應。更為重要的是，相對于目前已經(jīng)證實的KRAS/TP53共突變肺腺癌患者，TP53/DRGs共突變肺腺癌患者具有更高的腫瘤突變負荷和更長的無進展生存期，提示TP53/DRGs共突變能更好地預測免疫治療反應。

本研究也有一定的局限性，本研究是基于數(shù)據(jù)庫研究而得出的結論，但是納入國際數(shù)據(jù)庫的研究，往往具有嚴格的試驗篩選條件，排除了真實世界中免疫聯(lián)合化療或者免疫聯(lián)合化療等干擾問題；另外，為了避免單一數(shù)據(jù)集的結果偏倚，我們把納入的數(shù)據(jù)集分為測試集和驗證集，基于測試集得出的研究結論，經(jīng)過另外一個獨立的數(shù)據(jù)集進行驗證，從而提高了研究結果的可信性和外推性。

綜上所述，本研究結果初步表明，基因DRGs突變及其TP53共突變，可以在一定程度上預測肺腺癌的免疫治療療效，值得在后續(xù)臨床工作中進一步研究證實。