吳宏增，趙嘉政，趙祎，馬曉偉，馮和林

0 引言

橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS）是一種來源于骨骼肌肉的高度侵襲性的軟組織肉瘤，在兒童及青少年中多見[1]。盡管包括手術(shù)、化療和放療在內(nèi)的綜合治療使中、低度風(fēng)險RMS患者的5年生存率增加至約60%，但高風(fēng)險RMS患者的預(yù)后仍不樂觀[2]，迫切需要更好的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點。乏氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）在各種細(xì)胞中普遍表達(dá)，是正常和癌組織中缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其特定的負(fù)性轉(zhuǎn)變機制正逐漸被闡明，并且作為潛在的抗癌藥物靶點已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注[3]。組蛋白去甲基化酶JMJD2B是HIF-1α的下游靶點，其特征在于催化JmjC結(jié)構(gòu)域[4]，研究顯示高表達(dá)的JMJD2B在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移中發(fā)揮著重要作用[5]。本研究通過檢測JMJD2B和HIF-1α在RMS組織中的表達(dá)情況，探討JMJD2B和HIF-1α在RMS患者預(yù)后中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2012年1月—2014年12月確診的RMS石蠟組織標(biāo)本78例。同時收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、危險度、治療方案、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等臨床病理資料。本研究獲得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 所有標(biāo)本經(jīng)3.7%中性甲醛液固定，石蠟包埋，以4 μm厚度連續(xù)切片，HE染色。切片脫蠟水化后高壓修復(fù)15 min滴加一抗，置4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗后滴加二抗，室溫孵育20 min。顯色3～5 min，HE對比染色，固定。所用抗體包括兔抗人HIF-1α（Abcam公司，抗體編號ABP51513，稀釋度1:100），兔抗人JMJD2B抗體（Abcam公司，抗體編號A301-478A，稀釋度1:100）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法結(jié)果判定 所有病理切片由2位資深病理科專家分別判讀。于每張切片中挑選染色均勻5個不相鄰高倍視野（×400）測定免疫陽性細(xì)胞百分比。陽性標(biāo)記為棕黃色顆粒，且JMJD2B和HIF-1α陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞核。根據(jù)染色程度評價染色強度：染色陰性計0分，輕度染色計1分，中度染色計2分，強染色計3分；根據(jù)切片中陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞計0分，≤25%計1分，25%～50%計2分，＞50%～100%計3分。最后總評分=陽性強度評分×陽性百分比評分。0～3分為陰性（-）；4～9為陽性（+++）[6]。

1.2.3 實時定量PCR 將已切片的標(biāo)本組織，置入2.0 ml消毒離心管中；經(jīng)脫蠟水化后加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶K，55℃過夜，待組織溶解完全后用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取RNA。我們設(shè)計了GAPDH和JMJD2B的特異性引物，見表1。按照制造商的說明，使用LightCycler 480系統(tǒng)進(jìn)行PCR實驗。不添加UNG的50%SYBR GREEN通用PCR預(yù)混液（Applied Biosystems公司），正向和反向轉(zhuǎn)錄引物各50 nmol/L，反轉(zhuǎn)錄cDNA 2 μl。并設(shè)置擴增條件為95℃下5 min，然后進(jìn)行45個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃下10 s，55℃下1 min和72℃下10 s。將反應(yīng)物在95℃加熱15 s，在65°C加熱1 min以繪制熔解曲線，冷卻至50°C持續(xù)10 s。

表1 JMJD2B與GAPDH引物序列Table 1 Primer sequences of JMJD2B and GAPDH

1.2.4 隨訪 所有病例采用定期門診或電話隨訪。總生存期（overall survival,OS）定義為從確診RMS至死亡或末次隨訪日期的時間間隔。隨訪截至2020年1月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗和χ2檢驗，相關(guān)性驗證采用Spearman相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線、Log rank檢驗及Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

78例RMS患者中女性41例，男性37例。年齡范圍5～45歲，中位年齡8歲。生存時間范圍6～95月，中位生存時間61月。死亡32例，死亡原因均為腫瘤。具體各臨床病理參數(shù)見表2。

2.2 JMJD2B和HIF-1α的表達(dá)與RMS患者臨床病理特征的關(guān)系

78例RMS患者JMJD2B和HIF-1α表達(dá)陽性例數(shù)分別為46例（59.0%）和44例（56.4%），二者在RMS患者組織中的表達(dá)均高于陰性對照組（均P＜0.05），見圖1。統(tǒng)計學(xué)顯示JMJD2B和HIF-1α的表達(dá)水平與危險度級別、是否接受新輔助化療、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分型無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

圖1 免疫組織化學(xué)法分析HIF-1α(A,B)和JMJD2B(C,D)在橫紋肌肉瘤組織中的表達(dá) (IHC ×400)Figure 1 HIF-1α(A,B) and JMJD2B(C,D) expression levels in RMS tissues (IHC ×400)

表2 橫紋肌肉瘤患者臨床病理特征與JMJD2B和HIF-1α表達(dá)的關(guān)系Table 2 Relation between JMJD2B,HIF-1αexpression and clinicopathological characteristics of rhabdomyosarcoma patients

2.3 JMJD2B和HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示JMJD2B和HIF-1α表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P＜0.001,r=0.518），見表3。

表3 橫紋肌肉瘤患者JMJD2B和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Correlation between JMJD2B and HIF-1α expression in patients with rhabdomyosarcoma

2.4 JMJD2B mRNA表達(dá)水平驗證

實時定量PCR 實驗顯示蛋白表達(dá)陽性組的JMJD2B mRNA表達(dá)水平顯著高于陰性組（P＜0.001），見圖2。

圖2 實時定量PCR驗證橫紋肌肉瘤組織樣本中JMJD2B mRNA表達(dá)水平Figure 2 mRNA expression level of JMJD2B in rhabdom yosarcoma samples validated by quantitative real-time PCR

2.5 JMJD2B和HIF-1α的相關(guān)生存分析

Kaplan-Meier生存曲線顯示較高的危險度（P＜0.001）、未接受新輔助化療（P=0.009）、HIF-1α（P=0.009）和JMJD2B（P＜0.001）的高表達(dá)與較短的OS顯著相關(guān)，見圖3。單因素Cox回歸顯示危險度的級別、新輔助化療的有無、HIF-1α和JMJD2B表達(dá)水平的高低可以影響RMS患者的臨床預(yù)后（均P＜0.05），見表4。進(jìn)一步采用多因素Cox回歸顯示JMJD2B和危險度可作為RMS獨立的預(yù)后因素，見表5。JMJD2B高表達(dá)的RMS患者死亡風(fēng)險增加。

圖3 橫紋肌肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲線Figure 3 Kaplan-Meier survival curves of RMS patients

表4 橫紋肌肉瘤患者預(yù)后因素的單因素Cox分析Table 4 Univariate Cox analysis of prognostic factors for patients with rhabdomyosarcoma

表5 橫紋肌肉瘤患者預(yù)后因素的多因素Cox分析Table 5 Multivariate Cox analysis of prognostic factors for patients with rhabdomyosarcoma

3 討論

缺氧是實體瘤的常見特征，不僅在腫瘤發(fā)生中具有重要作用，還與轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加及不良臨床預(yù)后相關(guān)[7]。而作為缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵因子，HIF-1α通過調(diào)節(jié)糖酵解及相關(guān)輔助基因，幫助細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境并促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)變[8]。在本研究中，我們證實了HIF-1α在RMS組織中高表達(dá)并與低OS顯著相關(guān)，這與先前的發(fā)現(xiàn)一致，即HIF-1α在其他類型癌癥中的高表達(dá)會促進(jìn)腫瘤惡化，與患者的不良預(yù)后相關(guān)[9]。這一作用可能與HIF-1α參與包括Akt、NF-κB、Wnt在內(nèi)的多條信號通路有關(guān)，同時也為HIF-1α成為癌癥患者潛在新型預(yù)后檢測及治療靶點提供了有力證據(jù)[10-11]。

作為HIF-1α下游靶點，JMJD2B被發(fā)現(xiàn)啟動子序列中含有HIF-1α結(jié)合位點[12]。本試驗也證實了HIF-1α和JMJD2B表達(dá)的正相關(guān)性。國外已有研究證明JMJD2B在癌癥中高表達(dá)并導(dǎo)致不良臨床預(yù)后[13-14]，相關(guān)作用機制正被逐漸揭示。最新研究顯示，JMJD2B的外源表達(dá)以p53依賴的方式增強了結(jié)腸癌細(xì)胞的皮下腫瘤生長[15]。此外在骨肉瘤中，JMJD2B可能通過上調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子2的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。本研究發(fā)現(xiàn)JMJD2B和HIF-1α的高表達(dá)與高危組別、未接受新輔助化療、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高級別分期等不良臨床病理變量顯著相關(guān)。同時，JMJD2B和HIF-1α的高表達(dá)與OS的縮短顯著相關(guān)，但經(jīng)多因素Cox回歸分析，只有JMJD2B是獨立的預(yù)后指標(biāo)。這些表明了JMJD2B和HIF-1α可能是RMS病程中影響預(yù)后的重要因素。JMJD2B可能是一種新的RMS預(yù)后標(biāo)志物。然而JMJD2B和HIF-1α在RMS中的具體調(diào)控機制仍有待闡明。

本研究具有局限性。首先，免疫組織化學(xué)分析是半定量的，進(jìn)一步探討需要完善定量實驗方法。其次，樣本量較小，我們的結(jié)論應(yīng)該在更大的樣本中得到驗證。

綜上所述，JMJD2B和HIF-1α在RMS組織中高表達(dá)，并與不良臨床病理特征和不良預(yù)后有關(guān)。JMJD2B可作為RMS患者臨床預(yù)后的新指標(biāo)。