李圣豪，郝立園，國英琳，彭晴，丁靜茹，石新麗

0 引言

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）死亡率高居癌癥第三位[1]，是長期慢性炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)化為腫瘤的典型案例。目前，除手術(shù)和肝移植外，放化療是主要的治療手段，但放化療藥物的不良反應(yīng)及耐受性限制了其治療效果，使患者五年生存率低于30%[1]。因此，制定新的治療策略，對于肝癌治療及降低死亡率具有重要意義。

中藥有效組分配伍是中藥配伍的新模式。課題組前期研究已確定了丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B和原兒茶醛四種水溶性成分作用于動物的濃度和比例，并將此最佳組合命名為SABP[2]。另外也有研究表明，丹參多酚酸鹽（depsides salts）可以降低Ki-67和VEGF的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤的生長[3]。本研究利用H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤小鼠模型探討丹參水溶性組分SABP對H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤的作用以及對肝癌免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料及試劑

小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株H22由河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室曾瑞紅教授惠贈。接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。35只雄性BALB/c小鼠，4～6周齡，18～20 g，SPF級購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司。動物的飼養(yǎng)及操作通過河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：YXLL2018002）。丹參素、丹參酚酸A、丹參酚酸B及原兒茶醛（純度≥98%）均購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，批次分別為20180109、20180110、20180110及20 170606；0.9%氯化鈉溶液（批號：20160129）購自石家莊四藥有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤小鼠模型 將濃度為1×107個/毫升的H22肝癌細(xì)胞注射入5只BALB/c小鼠腹腔進(jìn)行腫瘤細(xì)胞復(fù)壯，每只小鼠的注射劑量為0.2 ml。7天后，用異氟烷麻醉小鼠，抽取腹腔腹水，并用0.9%氯化鈉溶液調(diào)整H22細(xì)胞濃度為2×106個/毫升。然后再取30只BALB/c小鼠進(jìn)行肝臟H22腫瘤細(xì)胞移植手術(shù)，具體手術(shù)步驟參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。每只小鼠肝臟注射H22肝癌細(xì)胞的劑量為0.05 ml。術(shù)后15天隨機(jī)抽取10只，取肝臟進(jìn)行HE染色，檢測造模成功率。隨后將剩余小鼠隨機(jī)分為對照組（NC組）和SABP組，每組10只。SABP組：腹腔注射SABP的劑量為0.1 ml/d，SABP作用小鼠的濃度及比例按本課題組前期發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行[2]。對照組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/d作為溶劑對照組。共注射15 d。

1.2.2 體重及肝、脾、腎系數(shù)的計算 每5天稱量體重一次。末次干預(yù)后，禁食不禁水6～12 h，異氟烷吸入麻醉后，摘除小鼠眼球取血，并處死動物。立即摘取肝、脾、腎，用濾紙吸干殘血后分別稱重，計算肝、脾和腎系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 肝臟組織勻漿后，收集上清液，標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測量OD450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的PD-L1、TGF-β、IL-1β、IL-10、IL-4、IFN-γ、IL-18、IL-7、IL-2、CCL-2和CCL-21的含量，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的方式表示，組間兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參水溶性組分SABP抑制H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤的生長

H22細(xì)胞進(jìn)行復(fù)壯后的狀態(tài)見圖1A。對照組小鼠的左肝葉可見兩處突出肝臟表面的白色硬質(zhì)瘤灶，正常肝組織顏色淡紅。SABP組小鼠的左肝葉可見一處明顯灰白色癌灶，而正常肝組織淡紅，見圖1B。此結(jié)果說明SABP可以抑制肝原位移植瘤的生長。

圖1 SABP抑制H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤的生長Figure 1 SABP inhibited growth of orthotopic transplantation of H22 cell liver cancer

2.2 SABP提高H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤小鼠脾重及肝、脾、腎系數(shù)

藥物處理第5、10和15天，SABP組與對照組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.8342、0.4937和0.0782），見圖2A。SABP組小鼠脾重量是對照組重量的1.29倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0156），見圖2B。SABP組小鼠肝、脾、腎系數(shù)分別是對照組1.19、1.34和1.23倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0327、0.0083和0.0381），見圖2C～E。

圖2 SABP對H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤小鼠體重(A)、脾重(B)和肝、脾、腎系數(shù)(C～E)的影響Figure 2 Effect of SABP on body weight(A),spleen weight(B)and coefficients of liver,spleen and renal(C-E) of orthotopic transplantation of H22 cell liver cancer in mice

2.3 SABP提高H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤PD-L1、TGF-β、IL-1β、IL-10和IL-4的表達(dá)水平

ELISA檢測結(jié)果顯示，SABP組PD-L1表達(dá)量是對照組的1.4倍（P=0.0433），見圖3A。SABP組TGF-β表達(dá)量是對照組的1.3倍（P=0.0228），見圖3B。SABP組小鼠的IL-1β表達(dá)量是對照組1.5倍（P=0.0153），見圖3C。SABP組小鼠的IL-10指數(shù)是對照組1.3倍（P=0.0156），見圖3D。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)SABP組IL-4表達(dá)量是對照組的1.19倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.2131），見圖3E。上述結(jié)果表明SABP可以通過上調(diào)PD-L1、TGF-β、IL-1β和IL-10的表達(dá)促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的形成。

圖3 SABP對H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤PD-L1、TGF-β、IL-1β、IL-10和IL-4表達(dá)的影響Figure 3 Effect of SABP on PD-L1,TGF-β,IL-1β,IL-10 and IL-4 expression in orthotopic transplantation of H22 cell liver cancer in mice

2.4 SABP不改變H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤中IFN-γ、IL-18、IL-7和IL-2的表達(dá)水平

SABP組小鼠IFN-γ、IL-18、IL-7和IL-2的表達(dá)水平分別為（5703.33±471.70）pg/g、（892.45±62.39）pg/g、（1288.74±105.65）pg/g和（3379.23±374.67）pg/g。對照組的表達(dá)水平分別是（5923.99±362.61）pg/g、（927.10±91.26）pg/g、（1496.07±55.41）pg/g和（2736.23±111.94）pg/g。SABP組和對照組IFN-γ、IL-18、IL-7和IL-2的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.5556、0.6160、0.0901和0.1163）。結(jié)果表明SABP不改變抗腫瘤免疫因子的表達(dá)水平。

2.5 SABP不影響H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤中CCL-2和CCL-21的表達(dá)水平

SABP組的CCL-2和CCL-21表達(dá)水平分別是（386.72±23.21）ng/g和（419.34±71.1）ng/g。對照組的表達(dá)水平分別是（495.09±67.66）ng/g和（388.72±34.87）ng/g。SABP組和對照組CCL-2和CCL-21表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0707和0.5395）。結(jié)果表明SABP不影響細(xì)胞趨化因子的表達(dá)水平。

3 討論

肝癌的主要臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”、“癥瘕”以及“肝積”等范疇。氣滯血瘀濕熱痰濁是肝癌發(fā)生的病理基礎(chǔ)。丹參（Salvia miltiorrhiza）味苦微寒，歸心肝經(jīng)，是一味活血化淤藥，同時還具有磨堅破滯、消癭除瘤的作用，具有“一味丹參，功同四物”之說。丹參素（danshensu,DSS）、丹酚酸A（salvianolic acid A,Sal-A）、丹酚酸B（salvianolic acid B,Sal-B）以及原兒茶醛（protocatechuic aldehyde,PAL）是丹參主要的水溶性成分。丹參素能降低蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）活性，從而抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長[5]。丹酚酸B通過激活線粒體途徑，抑制AKT/mTOR通路使肝癌細(xì)胞降解，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[6]。原兒茶醛靶向抑制肝癌細(xì)胞Wilms腫瘤蛋白1（Wilms tumor1,WT1）的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗肝癌作用[7]。上述研究均表明，丹參中主要水溶性成分均具有抑制肝癌細(xì)胞生長的作用。

SABP是丹參的四種水溶性成分的組合，本課題組前期研究也已證實(shí)SABP有一定的抗氧化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，丹參注射液治療能有效提高原發(fā)性肝癌患者免疫球蛋白水平，刺激CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的增殖，改善肝癌患者的免疫功能[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，SABP能抑制H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤的生長。有研究報道，丹參能使小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，SABP處理15天荷瘤小鼠的脾指數(shù)顯著升高。有研究表明丹酚酸B通過抗氧化，發(fā)揮對腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，恢復(fù)腎臟的功能[10]。本研究顯示，SABP處理提高了H22細(xì)胞肝癌原位移植瘤模型的腎系數(shù)，說明SABP無腎毒性。SABP不改變荷瘤小鼠的體重，因此SABP可能是通過調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮抗腫瘤的作用。

高表達(dá)程序性死亡配體1（programmed death ligand-1,PD-L1）的腫瘤細(xì)胞通過與T細(xì)胞表面的程序性死亡配體1（programmed death ligand-1,PD-1）相結(jié)合導(dǎo)致腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor Infiltrating Lymphocytes,TILs）功能的耗竭，從而導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的功能被抑制。PD-L1基因的敲除有助于肝臟中小鼠CD8+T細(xì)胞的積累，表明PD-L1是調(diào)節(jié)肝臟CD8+T細(xì)胞聚集和清除的關(guān)鍵蛋白。因此SABP通過促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的形成。骨髓來源的抑制細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β促進(jìn)CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，從而導(dǎo)致對腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）中PD-1/PD-L1阻斷的抵抗[11]。另外升高的TGF-β還可以阻斷未成熟的T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，促進(jìn)其向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cell,Treg）亞群轉(zhuǎn)化，并抑制樹突細(xì)胞的抗原呈遞功能，抑制CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的產(chǎn)生，從而造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[12]。IL-1β通過調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移[13]，M2型巨噬細(xì)胞到腫瘤組織的浸潤與預(yù)后不良有關(guān)[14]。另外，由于巨噬細(xì)胞表達(dá)CCL-2受體，因此CCL-2對巨噬細(xì)胞具有趨化性，這種信號分子在巨噬細(xì)胞的募集過程中發(fā)揮作用[15]。但是在本研究中發(fā)現(xiàn)SABP可以促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，但并不改變CCL-2的表達(dá)量，所以我們推斷SABP可能通過促進(jìn)IL-1β表達(dá)，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞到腫瘤組織的浸潤。

血清中高水平的IL-10與HCC患者的不良預(yù)后有關(guān)。IL-10可通過NF-κB和STAT3信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[16]。IL-10抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，并直接影響T細(xì)胞的分化和增殖。IL-10也可誘導(dǎo)肝癌中Treg的分化，Treg擴(kuò)張與HCC的侵襲性和患者較差的生存期密切相關(guān)[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)SABP促進(jìn)IL-10的表達(dá)，類似研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用丹酚酸B和原兒茶醛后IL-10的表達(dá)水平升高[18-19]。IL-10促進(jìn)輔助性T細(xì)胞分化為Th2。這為癌細(xì)胞提供了逃避免疫系統(tǒng)的機(jī)會[20]。IL-7作為T細(xì)胞發(fā)育和成熟T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞增殖[21]。IL-7刺激增加了外周和肝駐留CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這個過程伴隨著CD8+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的下調(diào)[22]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，SABP不改變IL-7、IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平，所以SABP發(fā)揮抗腫瘤作用不是基于正向調(diào)控抗腫瘤免疫應(yīng)答。

以上研究表明，SABP可以促進(jìn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成，主要是通過提高免疫抑制因子PD-L1、TGF-β、IL-1β和IL-10的水平發(fā)揮作用，而沒有通過改善抗腫瘤免疫的IFN-γ、IL-7、IL-18和IL-2來發(fā)揮抗腫瘤作用，也沒有改變腫瘤相關(guān)的趨化因子CCL-2和CCL-21。丹參水溶性成分SABP可以發(fā)揮抗腫瘤的作用，但是并沒有通過正向調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫發(fā)揮抗腫瘤的效果，反而提高免疫抑制信號分子的表達(dá)水平促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境形成，影響SABP的抗腫瘤作用。后期本課題組將進(jìn)一步探討SABP發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制，聯(lián)合相關(guān)免疫治療藥物PD-1單抗或PD-L1單抗，觀察SABP的抗腫瘤作用。