龍文清，張暉力，謝海娟，王毓興，張麗君，俞紅女，王林

0 引言

肺癌是全球最常見的癌癥相關死亡原因之一，以高發(fā)病率和高死亡率居于首位，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者約占所有肺癌患者人數的85%[1]。除手術治療外，肺癌已成為分子靶向治療實體瘤成功的范例。基因檢測技術的改進和普及使分子靶向治療變得更精準、更有成效，例如肺癌ERBB2、MET、RET、NTRK1和EGFR的聯合檢測和治療[2-4]。對于錯過最佳手術治療階段的晚期NSCLC患者，以鉑類為主的多藥聯合化療方式是主要治療手段。順鉑（DDP）是目前臨床Ⅱ～Ⅲ期完全手術切除腫瘤的NSCLC患者的主要治療輔助手段[5]。迄今為止，鉑類化療藥物對癌細胞的毒性作用仍未完全闡明。研究表明順鉑與DNA的結合效率只有5%～10%[6]。Panx1是Pannexin家族中的一員。Pannexin家族有三個成員，分別是Panx1、Panx2和Panx3。與傳統縫隙連接蛋白通道不同的是，Panx蛋白并不形成具有細胞與細胞間進行物質交換功能的縫隙連接通道，而是只形成同一細胞本體的胞內到胞外形式的單個膜通道[7]。近來研究表明，Panx1通道參與順鉑誘導睪丸癌I-10細胞的凋亡，而Panx1在順鉑誘導A549凋亡過程中的作用至今仍未見報道。本研究探討Panx1通道在順鉑誘導A549細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌細胞株（A549）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、含EDTA的胰酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司，不含EDTA的胰酶購自大連索萊寶生物公司，PBS購自美國HyClone公司，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海詡圣生物公司，增強型ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司，IP3檢測試劑盒購自武漢華美生物公司，MTT和DMSO購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h換液1次，72 h傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測細胞生存率 取10 cm培養(yǎng)皿中生長至50%左右融合度的A549細胞，胰酶消化、計數，調整細胞的密度為1×105個/毫升，將細胞懸浮液鋪至96孔板，10列×6行，每孔100 μl。24 h后更換藥物培養(yǎng)基。實驗共分10組，每組設置6個復孔。Control組不作處理，CBX組：100 μmol/L甘珀酸（CBX）；DDP組：0、2、4、6、8 μg/ml DDP；CBX+DDP組：0、2、4、6、8 μg/ml DDP+100 μmol/L CBX。其中CBX+DDP組提前1 h加入CBX，讓CBX充分發(fā)揮對Panx1的抑制作用。24 h后更換成含濃度為5 mg/ml MTT的培養(yǎng)基，避光操作。繼續(xù)培養(yǎng)1 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μl DMSO，490 nm下讀取每孔吸光度值。

1.2.3 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡率 將細胞以1×105個/毫升的密度鋪至6孔板，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h后，更換藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌細胞，1500 r/min，4℃，離心5 min，重復2次。采用100 μl 1×Binding Buffer重懸細胞。加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI Staining Solution，輕緩混勻。室溫、避光下反應15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer，流式細胞儀檢測。

1.2.4 化學發(fā)光法檢測胞外ATP釋放濃度 將細胞以1×105個/毫升的密度接種于12孔板。分為4組：對照組、DDP組、CBX組和CBX+DDP組，每組三個復孔，不作處理細胞為對照組，DDP濃度為8 μg/ml，CBX濃度為100 μmol/L。18 h后取細胞外培養(yǎng)基作為檢測樣品，4℃條件下12 000g離心，離心5 min。將各個樣品裝入黑色96孔板，每孔先加入100 μl按照1:4稀釋好的ATP檢測工作液和20 μl樣品，迅速混勻，將多功能酶標儀調至luminometer檢測模式，避光檢測。

1.2.5 ELISA法檢測胞內IP3濃度 細胞接種、藥物處理及分組與1.2.4步驟一致。藥物處理18 h后，預冷PBS洗滌一次，置入-20℃冰箱。兩次凍融后，4℃條件下5 000g離心，離心5 min。取上清液作為檢測樣品。取50 μl樣品，加入50 μl酶標試劑，再加入50 μl抗體，混勻，37℃，避光孵育1 h。倒掉液體，每孔加入200 μl洗滌液進行清洗，靜置10 s，重復3次。每孔加入50 μl顯色液A和50 μl顯色液B，混勻，37℃，避光孵育15 min。加入50 μl終止液，混勻后置于酶標儀下，450 nm波長下讀取每孔吸光度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS20.0軟件對數據進行分析，結果以均數±標準差表示。組內比較采用One-way ANOVA分析，組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CBX與DDP合用對細胞生存的影響

結果顯示，對照組細胞生存率為0.9941±0.0042，CBX組的細胞生存率為0.9905±0.0089，與對照組比較差異無統計學意義（P=0.557），表明CBX不會對A549細胞的生存產生影響；2、4、6、8 μg/ml DDP組細胞生存率分別為（0.9267±0.0252、0.8253±0.0393、0.7445±0.0696、0.6782±0.0365），與對照組比較，DDP組細胞生存率降低（P=5.34×10-6、8.80×10-10、1.85×10-11、1.79×10-12）；應用CBX（100 μmol/L）抑制Panx1通道后，CBX+DDP（2、4、6、8 μg/ml）組的細胞生存率分別為（0.9692±0.0122、0.9074±0.0109、0.8562±0.0214、0.8129±0.0301），與DDP組比較差異有統計學意義（均P＜0.001），見圖1。

圖1 甘珀酸與順鉑合用對A549細胞生存的影響Figure 1 Effect of carbenoxolone (CBX) combined with cisplatin (DDP) on survival of A549 cells

2.2 CBX與DDP合用對細胞凋亡的影響

對照組的細胞凋亡率為（6.07±0.25）%，單用CBX（100 μmol/L）組的細胞凋亡率為（6.00±0.05）%，與對照組比較差異無統計學意義（P=0.8 1 5）。結果證實CBX 不會對A549細胞的凋亡產生影響。單用DDP組（2、4、6和8 μg/ml），細胞凋亡率分別為（7.48±0.23）%、（13.38±0.21）%、（20.37±0.30）%和（34.75±0.36）%，與對照組比較凋亡率升高（P=0.528、0.007、5.81×10-5、1.10×10-7）。而應用CBX（100 μmol/L）抑制Panx1通道的功能后，CBX+DDP（2、4、6、8 μg/ml）組的細胞凋亡率分別為（6.71±0.11）%、（8.34±0.25）%、（13.77±0.26）%、（26.02±0.46）%，與DDP組比較差異有統計學意義（P=0.035、0.006、0.012、0.040），見圖2。

圖2 順鉑單用(A)以及與甘珀酸聯合(B)對A549細胞凋亡的影響Figure 2 Effect of cisplatin alone(A) and CBX+DDP(B) on apoptosis of A549 cells

2.3 CBX與DDP合用對胞外ATP釋放濃度的影響

對照組細胞外ATP釋放濃度為1±0.0183，CBX組和DDP組的胞外ATP釋放濃度分別為0.6539±0.0556和1.8828±0.0497，與對照組比較，CBX組細胞外ATP濃度降低，DDP組細胞外ATP濃度升高；CBX+DDP組的胞外ATP釋放濃度為1.1969±0.0319，與DDP組比較差異均有統計學意義，見圖3。

圖3 甘珀酸與順鉑聯合對A549細胞胞外ATP釋放濃度的影響Figure 3 Effect of CBX+DDP on extracellular ATP release of A549 cells

2.4 CBX與DDP合用對胞內IP3濃度的影響

對照組的胞內IP3濃度為1±0.0287，CBX組的胞內IP3濃度為0.9981±0.0020，與對照組比較差異無統計學意義（P=0.178），表明CBX不會對A549細胞的胞內IP3濃度產生影響；DDP組的胞內IP3濃度為1.3202±0.0429，與對照組比較，DDP組的胞內IP3濃度升高；CBX+DDP組的胞內IP3濃度為1.0143±0.0255，與DDP組比較差異均有統計學意義，見圖4。

圖4 CBX與DDP合用對A549細胞胞內IP3釋放濃度的影響Figure 4 Effect of CBX+DDP on intracellular IP3 release of A549 cells

3 討論

肺癌的治療是精準醫(yī)學時代的巨大挑戰(zhàn)，大多數NSCLC患者常在手術后出現轉移或復發(fā)，反映了這類癌癥的侵襲性和患者的預后不良。對于多數NSCLC患者，鉑類化療仍然是一種標準治療方法。此外，對于晚期NSCLC患者和需要誘導/輔助治療的早期疾病患者，鉑類中又以順鉑用途最為廣泛。順鉑進入細胞后，與胞內DNA結合成化合物進而抑制細胞的增殖。然而，在絕大多數情況下，暴露于順鉑的惡性腫瘤細胞能夠激活適應性抗性機制。因此，大部分接受順鉑治療的患者都遇到治療失敗和腫瘤復發(fā)的困擾。

Panchin 等[8]發(fā)現，Panx1 通道是在人體多器官中表達的由糖蛋白形成的一種半通道。Jalaleddine等[9]研究證實Panx1通道的抑制劑或基因缺失可降低乳腺癌的轉移效率。Shi等[10]研究發(fā)現Panx1的高表達與肝癌的預后不良相關，并可促進肝癌的生長、轉移和侵襲。Liu等[11]研究發(fā)現用shRNA敲除Panx1之后，睪丸癌細胞（I-10）系的遷移和侵襲能力減弱。這些研究證實在某些腫瘤細胞中Panx1的表達上調，并且可以增加某些腫瘤細胞的轉移能力。因此，選擇性抑制Panx1的表達和功能可能為某些腫瘤的治療帶來新思路。

Panx1是絕大多數細胞類型中ATP流出的主要途徑[12]。Panx1是嘌呤能信號轉導中的多功能調節(jié)伙伴，因為它參與了嘌呤能信號多種生理和病理作用的過程。Panx1的這些作用很大程度上歸因于它們釋放ATP或其他核苷酸的能力，這些核苷酸以自分泌或旁分泌的方式支持嘌呤能信號的轉導[13]。ATP可以通過多種途徑參與腫瘤代謝過程，其中一種重要的機制是在腫瘤細胞缺氧條件下葡萄糖攝取和糖酵解的增加從而引起ATP水平的變化[14]。

本研究中，在應用順鉑的前提下，Panx1通道被CBX高選擇性抑制后，相對于單用順鉑的分組，A549細胞的生存增加，早期凋亡和晚期凋亡減少?？赡苁怯捎赑anx1通道被抑制導致順鉑誘導A549細胞凋亡過程中的一個重要途徑被阻斷所致。相對于單用DDP組，CBX+DDP組的胞外ATP釋放濃度下降，證明Panx1通道是順鉑引起A549細胞凋亡進程中ATP釋放的關鍵途徑。CBX與順鉑合用后，A549細胞內的IP3的濃度下降?？赡苁怯捎赑anx1通道被抑制，胞內ATP逸出到細胞外的重要途徑被切斷，導致胞外ATP濃度降低，進而使胞內IP3的相對濃度減少。

綜上所述，Panx1通道介導的ATP/IP3通路在順鉑誘導A549細胞凋亡過程中起重要作用。Panx1通道通過調控ATP/IP3信號通路增加順鉑對肺腺癌細胞的敏感度，為改善NSCLC患者的順鉑化療敏感度提供了一定的幫助。