陶一凡，張小強，李琪，孫騰騰，崔丹丹

環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，東南大學公共衛(wèi)生學院，南京 210000

納米二氧化鈦顆粒(Nano-titanium dioxide, Nano-TiO2)是介于原子、分子和宏觀體系之間的一種新型納米材料，除了具備TiO2基本的特性外，還具備一些特殊的理化性質，例如，屏蔽紫外線的功能強，分散性和耐候性良好。Nano-TiO2可用于化妝品、功能纖維、塑料、涂料和油漆等產品中，可作為紫外線屏蔽劑，防止紫外線的侵害[1]。近幾年來，Nano-TiO2在抗菌食品包裝材料[2-4]、食品添加劑[5]等方面的應用日益廣泛[6]。在我們日常食物中，如咖啡伴侶、口香糖、巧克力、各類硬糖、軟糖和奶制品等中均含有的顆粒大小不等的Nano-TiO2[7]。

隨著納米材料的應用越來越廣，人們與其的接觸機會也大大增加，其安全性問題也引起了人們的關注。相關體內實驗研究表明，Nano-TiO2可能會穿過胎盤屏障而影響胚胎的大腦發(fā)育[8]；可能會損害神經元或神經膠質細胞的形態(tài)和功能，從而導致細胞壞死[9]；可以通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，引起神經元損傷、神經炎癥反應等[10]；會使得血腦屏障的通透性增加，維持血腦屏障的緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-5表達受到干擾[11]；會影響動物的空間學習能力和記憶能力，導致空間記憶的紊亂，這也意味著Nano-TiO2可能在大腦中積累從而導致神經退行性變[8]。

小膠質細胞在大腦發(fā)育早期就已存在，幾乎均勻分散在整個中樞神經系統(tǒng)當中。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中的巨噬細胞，是人體中樞神經系統(tǒng)中的第一道也是最主要的一道免疫防線[12]。小膠質細胞被認為是最敏感的腦病理傳感器，一旦發(fā)現(xiàn)腦損傷或神經系統(tǒng)功能障礙的跡象，小膠質細胞將經歷一個復雜的、多階段的激活過程，將其轉化為“激活的小膠質細胞”[13]。大量活化的小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)內促炎因子和自由基等神經毒性物質的重要來源[12]。不受控制或過度激活的小膠質細胞可能會產生過多的炎性細胞因子、炎性因子和自由基，從而加劇組織損傷和神經元死亡[14]。Nano-TiO2作為納米材料中廣泛使用的消費品，可以通過各種途徑進入體內，穿過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)中[11]，而小膠質細胞作為腦內的免疫細胞，Nano-TiO2對小膠質細胞的毒作用機制一直備受關注[15-16]。

Notch信號通路在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調節(jié)細胞、組織、器官的分化和發(fā)育。大量研究表明，Notch信號通路可促進細胞的炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡，且與免疫調節(jié)密切相關[17-19]。本研究使用不同濃度的Nano-TiO2染毒小膠質細胞，進而研究Nano-TiO2對小膠質細胞活性、其細胞膜的完整性及炎癥因子的分泌情況的影響，重點探討了Nano-TiO2對Notch信號通路的激活作用，從而更深一步地揭示Nano-TiO2誘導小膠質細胞炎癥反應的分子機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑

小膠質細胞(BV2)(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心)；Nano-TiO2顆粒(德國Degussa公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國HyClone公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(德國默克Sigma公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

馬爾文粒徑分析儀(Zetasizer Nano-ZS90，英國Malvern公司)；酶標分析儀(RT-6000，美國Rayto公司)；轉印電泳槽(DYCZ-40D，北京六一儀器廠)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備Nano-TiO2染毒懸液

使用電子天平精確稱量一定量的Nano-TiO2粉末，加入完全培養(yǎng)基配成的母液。使用前超聲震蕩，根據實驗需要稀釋成相應濃度。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

將小膠質細胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行實驗。

1.3.3 Nano-TiO2顆粒表征

稀釋Nano-TiO2母液，使用馬爾文粒度分析儀，通過動態(tài)光散射檢測Nano-TiO2工作溶液中Nano-TiO2的粒徑、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位。

1.3.4 MTT法測定細胞存活率

在小膠質細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以1×104個·mL-1的濃度接種到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。在細胞貼壁后，將它們分為空白組、對照組和Nano-TiO2處理組，濃度分別為15.0、20.0、30.0、40.0和50.0 μg·mL-1。每組有5個復孔，并繼續(xù)孵育24 h。向每個孔中添加10.0 μL濃度為5.0 mg·mL-1MTT溶液，并繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。每孔中加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床上震蕩，使晶體完全溶解。用酶標儀檢測吸光度D(560)值并計算細胞活力。

細胞存活率(%)=[D(560)實驗組-D(560)空白組]/[D(560)對照組-D(560)空白組]×100%

1.3.5 細胞培養(yǎng)液上清中LDH活性測定

取置于對數(shù)生長期的小膠質細胞，以6×104個·孔-1的濃度接種到24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。細胞貼壁后，加入含有不同濃度(0、15.0、20.0、30.0和40.0 μg·mL-1)的Nano-TiO2的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取上清培養(yǎng)液，離心后取上清。設置標準空白孔，在450 nm處測量光密度值，計算LDH活性，并根據LDH試劑盒說明確定細胞膜完整性。

LDH活性(U·L-1)=[(測定孔OD值-對照組OD值)/(標準孔OD值-空白孔OD值)]×標準品濃度×1000

1.3.6 ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α分泌水平

取置于對數(shù)生長期的小膠質細胞，以6×104個·孔-1的濃度接種在24孔板中培養(yǎng)。細胞貼壁后，分別添加不同濃度的Nano-TiO2的完全培養(yǎng)基(0、15.0、20.0、30.0和40.0 μg·mL-1)。培養(yǎng)24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，離心20 min并取上清液。根據ELISA試劑盒說明進行實驗，在450 nm處測量光密度值。根據標準曲線測定樣品中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平。

1.3.7 Western Blot法檢測Notch信號通路相關蛋白表達水平

將處于對數(shù)生長期的小膠質細胞以8×105個·mL-1的濃度接種在6孔板中培養(yǎng)。細胞貼壁后，添加不同濃度Nano-TiO2的完全培養(yǎng)基(0、15.0、20.0、30.0和40.0 μg·mL-1)，繼續(xù)孵育24 h。使用RIPA裂解液裂解細胞并提取蛋白質。在4 ℃、12 000 r·min-1離的條件下離心15 min并取上清液。用BCA蛋白質定量試劑盒確定提取的蛋白濃度后，制膠、上樣、電泳、轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗Notch-1抗體、Hes-1抗體和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，洗膜，二抗孵1.5 h后，洗膜并曝光顯色。使用Image J(v1.47)軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

設立對照組(不施加任何處理)、抑制劑對照組、DAPT+Nano-TiO2共同處理組(Nano-TiO2干預前1.5 h加(γ-分泌酶抑制劑(DAPT))、Nano-TiO2處理組(40 μg·mL-1)。采用蛋白質印跡法(Western Blot)分別測定各組Notch-1、Hes-1蛋白表達變化情況，用ELISA法測定各組炎癥因子分泌水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據表示為均值±標準差。應用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組之間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。兩兩比較時，若方差齊則采用LSD-t檢驗，若不齊則用Dunnett’s T3檢驗。趨勢分析采用Spearman相關分析，結果以相關系數(shù)(r)表示。檢驗水準取α=0.05。

2 結果(Results)

2.1 Nano-TiO2的表征

Nano-TiO2的平均水合粒徑為(73.55±3.29) nm，Zeta電位為(-5.74±0.63) mV，PDI為0.19±0.1，根據上述結果可知Nano-TiO2的混合分散體系較為穩(wěn)定。

2.2 細胞活力

如圖1所示，與對照組相比，Nano-TiO2濃度為40.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1時，細胞活力顯著降低(P<0.05)。不在同濃度的Nano-TiO2暴露條件下，暴露濃度越高，細胞活性越低(r=-0.745，P<0.05)。

圖1 Nano-TiO2對小膠質細胞BV2細胞活力的影響注：*與對照相組比，P<0.05。Fig. 1 Effect of Nano-TiO2 on the cell viability of microglia BV2 cellsNote: *represent P<0.05 compared with the control group.

2.3 LDH活性

如圖2所示，與對照組相比，Nano-TiO2在20.0、30.0和40.0 μg·mL-1的濃度時，細胞培養(yǎng)液上清中的LDH活性升高(均P<0.05)。隨著Nano-TiO2暴露濃度的增加，細胞培養(yǎng)液上清LDH活性也同時增加(r=0.960，P<0.05)。

圖2 不同濃度的Nano-TiO2處理24 h后BV2細胞的LDH活性注：*與對照相組比，P<0.05。Fig. 2 LDH activity of BV2 cells treated with different concentrations of Nano-TiO2 for 24 hNote: *represent P<0.05 compared with the control group.

2.4 TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平

如圖3所示，與對照組相比，Nano-TiO2在15.0、20.0、30.0和40.0 μg·mL-1的濃度時，細胞上清液中的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平升高(均P<0.05)，劑量-效應關系明顯(rTNF-α=0.901，P<0.05；rIL-1β=0.959，P<0.05；rIL-6=0.958，P<0.05)。

圖3 不同濃度Nano-TiO2處理24 h后BV2細胞炎癥因子分泌水平注：*與對照組相比，P<0.05。Fig. 3 Secretion of inflammatory factors in BV2 cells treated with different concentrations of Nano-TiO2 for 24 hNote: *represent P<0.05 compared with the control group.

2.5 Notch信號通路相關蛋白表達水平

如圖4所示，與對照組相比，Nano-TiO2在20.0、30.0和40.0 μg·mL-1的暴露濃度下，Notch-1及Hes-1表達水平升高(P<0.05)，且Notch-1及Hes-1蛋白表達水平的改變與Nano-TiO2暴露濃度存在劑量-效應關系(rNotch-1=0.894，P<0.05；rHes-1=0.739，P<0.05)。

圖4 不同濃度Nano-TiO2處理24 h后BV2細胞Notch信號通路相關蛋白表達水平注：*表示與對照組相比，P<0.05；(a)，Hes-1、Notch-1蛋白表達(Western Blot法)；(b)，Notch-1/β-actin灰度值比值；(c)，Hes-1/β-actin灰度值比值。Fig. 4 Expression levels of Notch signaling pathway related proteins in BV2 cells treated with different concentrations of Nano-TiO2 for 24 hNote: *represent P<0.05 compared with the control group; (a), Hes-1 and Notch-1 protein expression by Western Blot method; (b), the ratio of Notch-1 to β-actin; (c), the ratio of Hes-1 to β-actin.

2.6 Notch信號通路在Nano-TiO2誘導小膠質細胞產生炎癥因子中的作用

如圖5所示，在40.0 μg·mL-1Nano-TiO2作用下，Notch-1及Hes-1表達明顯增加(P<0.05)；加入DAPT后，Notch-1及Hes-1表達水平降低(P<0.05)。與對照組相比，Notch通路抑制劑DAPT(10.0 μmol·L-1)對小膠質細胞TNF-ɑ、IL-6及IL-1β分泌無明顯影響。結果表明，DAPT可有效降低TNF-ɑ、IL-6和IL-1β分泌水平(P<0.05)。

圖5 γ-分泌酶抑制劑(DAPT)對Nano-TiO2所致Notch信號通路表達及炎癥因子分泌的影響注：#表示與對照組相比，P<0.05；*表示與Nano-TiO2暴露組相比，P<0.05；(a)，Hes-1、Notch-1蛋白表達(Western Blot法)；(b)，Notch-1/β-actin灰度值比值；(c)，Hes-1/β-actin灰度值比值；(d)～(f)，TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的分泌水平。 Fig. 5 Effects of γ-secretase inhibitor (DAPT) on the expression of Notch signaling pathway and secretion of inflammatory factors induced by Nano-TiO2Note: # represent P<0.05 compared with the control group; *represent P<0.05 compared with Nano-TiO2 exposure group; (a), Hes-1 and Notch-1 protein expression by Western Blot method; (b), the ratio of Notch-1 to β-actin; (c), the ratio of Hes-1 to β-actin; (d)～(f), the secretion of TNF-α, IL-1β and IL-6.

3 討論(Discussion)

Nano-TiO2是使用最多的納米顆粒之一，很多日常生活用品中均有添加。納米顆粒能夠隨血液循環(huán)進入大腦并穿過血腦屏障，引起血腦屏障損傷、神經炎癥反應，從而導致中樞神經系統(tǒng)受損[8-9]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測小膠質細胞的Notch通路的相關效應因子，通過干預Notch信號途徑，導致小膠質細胞分泌炎性因子發(fā)生改變并且其吞噬作用增強，證明了Notch信號系統(tǒng)對于小膠質細胞的炎性表達有重要調節(jié)作用。但目前關Nano-TiO2能否通過激活小膠質細胞里的Notch信號通路，進而導致細胞炎癥反應增強的相關研究報道較少。因此本研究采用小膠質細胞暴露于Nano-TiO2顆粒，探討Nano-TiO2對Notch信號通路的影響，判斷Notch信號通路在Nano-TiO2導致小膠質細胞炎癥反應水平改變中的作用。

本研究結果表明，小膠質細胞暴露于Nano-TiO2導致細胞活力下降，并存在劑量-效應關系，本研究MTT實驗的細胞染毒劑量為15.0、20.0、30.0、40.0和50.0 μg·mL-1，當暴露劑量為50.0 μg·mL-1時，細胞活力明顯下降，出現(xiàn)明顯的細胞毒性，所以本研究后續(xù)實驗的細胞染毒劑量為15.0、20.0、30.0和40.0 μg·mL-1Nano-TiO2。

在不同濃度Nano-TiO2暴露條件下，細胞培養(yǎng)液上清LDH活性隨Nano-TiO2濃度增加而增加，這說明Nano-TiO2在一定濃度條件下可以對小膠質細胞膜的完整性造成一定程度的破壞。這些結果與Rihane等[15]的研究報道一致。并且其他體內研究也表明，實驗動物通過各種給藥途徑接受Nano-TiO2后，主要器官中Nano-TiO2顆粒的含量增加，進而誘發(fā)氧化應激和器官功能障礙[20]。通過飲用水暴露于Nano-TiO2的小鼠肝臟中的8-羥基脫氧鳥嘌呤水平升高，DNA受損[21]。通過管飼法將小鼠暴露于Nano-TiO2后，肝臟、腎臟、腦皮質和海馬中的Nano-TiO2含量升高。本研究結果顯示，Nano-TiO2濃度為15.0、20.0、30.0和40.0 μg·mL-1，小膠質細胞TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平均升高，具有明顯的劑量-效應關系，且較低濃度的Nano-TiO2(15 μg·mL-1和20 μg·mL-1)就能刺激小膠質細胞分泌相關炎癥因子。Nano-TiO2刺激了小膠質細胞，使其炎癥因子分泌增加，使得細胞生存環(huán)境惡化，造成細胞自身的持續(xù)激活，炎癥因子持續(xù)釋放，進而導致神經炎癥及神經元損傷，造成神經毒性結局[22]。

Notch信號通路是參與調節(jié)炎癥反應通路的重要通路之一。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子的表達與Notch信號通路的表達呈正相關[18-19,23]。本研究中，Notch信號通路相關蛋白表達的結果表明，Nano-TiO2暴露引起小膠質細胞中Notch-1和Hes-1表達水平增加，由此說明Nano-TiO2可激活小膠質細胞中Notch信號通路；在Nano-TiO2暴露組中加入Notch信號通路抑制劑DAPT后發(fā)現(xiàn)，相較于未加抑制劑的Nano-TiO2暴露組，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平下降，由此可知，Notch 信號通路的激活會促進炎癥因子的分泌。有研究表明[18]，經脂多糖(LPS)誘導活化后的小膠質細胞大量釋放IL-12、TNF-α和iNOS等炎癥介質，用DAPT阻斷Notch信號通路后，M1型小膠質細胞釋放炎癥介質減少并向M2型小膠質細胞演變，同時M2型細胞釋放抑炎因子IL-10，這提示Notch信號通路參與小膠質細胞炎癥的發(fā)生發(fā)展，這與本研究結果一致。由此我們推斷，Notch信號通路與小膠質細胞內炎癥因子的分泌有著相關性，Nano-TiO2顆粒可以使小膠質細胞內的Notch信號通路表達增強并促使炎癥因子釋放增加，Notch信號通路表達增強對小膠質細胞炎癥因子分泌水平起到重要作用。

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