楊押佐 賈 婷 張 浩 王政昆 朱萬龍*

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，昆明，650500；2.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，昆明，650106)

當(dāng)環(huán)境發(fā)生季節(jié)性變化時，小型哺乳動物(Mammalia)的體重也會發(fā)生變化[1]。野生小型哺乳動物體重的季節(jié)性變化模式主要分為穩(wěn)定型、降低型和增加型[2]。季節(jié)性穩(wěn)定型主要符合“調(diào)定點(diǎn)假說”(set-point hypothesis)，該假說最先由學(xué)者Kennedy[3]提出，即機(jī)體的體重調(diào)控中樞能夠使體重值保持相對穩(wěn)定。季節(jié)性降低型的動物在秋冬季或低溫條件下體重降低，如黑線毛足鼠(Phodopussungorus)在秋季由于食物攝取量減少，體重也減少[4]。而季節(jié)性增加型則出現(xiàn)相反的趨勢，秋冬季或低溫條件體重增加。內(nèi)臟器官和消化道的重量變化對動物的體重具有重要影響，因此可作為動物適應(yīng)環(huán)境的重要指標(biāo)，其重量的變化主要受到溫度、食物質(zhì)量等因素的影響[5]。例如，在低溫環(huán)境中大絨鼠(Eothenomysmiletus)通過增加消化道和器官重量來確保機(jī)體的正常運(yùn)行[6]。當(dāng)發(fā)生季節(jié)變化時，高山姬鼠(Apodemuschevrieri)的身體組成和內(nèi)臟器官重量同樣會表現(xiàn)出季節(jié)性變化[7]。

代謝產(chǎn)熱的適應(yīng)性調(diào)節(jié)是小型哺乳動物適應(yīng)環(huán)境變化的重要策略，其中，靜止代謝率(resting metabolic rate，RMR)和非顫抖性產(chǎn)熱(non-shivering thermogenesis，NST)在這一過程中具有重要作用[8]。研究表明，NST主要在小型哺乳動物的冷適應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[9]。例如，冷馴化條件下大絨鼠的NST增加，以抵抗低溫環(huán)境的脅迫[10]。肝臟和褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)的總蛋白(total protein，TP)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和線粒體蛋白(mitochondrial protein，MtP)質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及相關(guān)酶活是研究哺乳動物產(chǎn)熱特征的重要指標(biāo)[11]。細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)在細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)催化分子氧的還原，其活性代表了細(xì)胞代謝強(qiáng)度的能力[12]。α-磷酸甘油氧化酶(α-glycerophosphate oxidase，α-GPO)主要分解代謝甘油三酯，能夠反映細(xì)胞脂肪氧化分解作用的強(qiáng)弱[13]。

瘦素通過與下丘腦中的受體結(jié)合，可以抑制動物的食物攝入，改變自主神經(jīng)活動，增加能量消耗[14]。下丘腦因其能調(diào)節(jié)相關(guān)食欲神經(jīng)肽的表達(dá)、參與食欲調(diào)控而成為能量調(diào)節(jié)中樞[15]。主要的食欲神經(jīng)肽包括促食類和抑食類神經(jīng)肽，分別是神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti related peptide，AgRP)、阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)和可卡因-安他非明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide，CART)[16]。

昭通絨鼠(Eothenomysolitor)為嚙齒目(Rodenria)，倉鼠科(Cricetidae)，絨鼠屬，是中國的特有物種，主要分布于云南東北部(昭通)和西部等地，常見于高山耕地[17]。冬天，它主要以植物莖葉為食，夏天以農(nóng)作物種子為食[18]。云南省昭通地區(qū)地勢西高東低，有較完整的高原地貌，海拔為267—4 040 m，平均海拔為1 685 m；為典型的中溫帶氣候和高原大陸季風(fēng)氣候，干濕季節(jié)分明，氣溫季節(jié)差異顯著，年平均氣溫11.6℃，常年極端低溫-8.3℃，年溫差小，日溫差較大[19]。本研究組之前的研究表明，在冷馴化條件下昭通絨鼠體重保持相對穩(wěn)定，產(chǎn)熱能力增加[20]。筆者主要研究昭通絨鼠夏季和冬季體重與產(chǎn)熱特征的變化，旨在進(jìn)一步探討昭通絨鼠對其生活環(huán)境的適應(yīng)策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

分別于2019年5月和11月捕自云南省昭通市周邊的農(nóng)田附近(27.3°N，103.6°E)。夏季和冬季樣本各12只，其中夏季♀∶♂=8∶4；冬季♀∶♂=2∶10，均為健康的非繁殖期昭通絨鼠成年個體。捕回的動物于云南師范大學(xué)動物房進(jìn)行單籠(26 cm×16 cm×15 cm)飼養(yǎng)，其環(huán)境光照為12L∶12D，且水食自取。捕回4 d內(nèi)測定體重、食物攝入量、RMR和NST，試驗(yàn)后處死動物，測定血清瘦素質(zhì)量濃度、內(nèi)臟器官和消化道重量、體脂重量、肝臟和BAT中的生化指標(biāo)以及下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量。試驗(yàn)動物程序符合動物倫理并通過云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院委員會的批準(zhǔn)(13-0901-011)。

1.2 食物攝入量測定

采用食物平衡法[7]測定昭通絨鼠的食物攝入量，每日于09：00—10：00完成喂食，次日相同時間段收集剩余食物置于烘箱中60℃烘干至重量不變，每日食物攝入量=食物供給量-剩余食物量。

1.3 RMR和NST測定

采用小型哺乳動物代謝籠(PRO-MRMR-8 Sable Systems International Inc)測定昭通絨鼠的RMR。試驗(yàn)開始前先將動物置于小型哺乳動物代謝籠中適應(yīng)30 min，監(jiān)測和記錄RMR。在RMR測定后，迅速取出試驗(yàn)動物，在肩胛間部位注射去甲腎上腺素(NE)，注射劑量經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)確定為0.8 mg/kg，注射完再放回代謝籠內(nèi)測定NST，持續(xù)測定30 min，最大持續(xù)耗氧量出現(xiàn)時即為動物的NST[21]。

1.4 血清瘦素質(zhì)量濃度測定

試驗(yàn)動物處死后迅速取血，取出的血液于冰箱中4℃靜置1 h后，4 000 r/min離心30 min，取出上層血清置于-80℃超低溫冰箱保存，采用美國Linco公司生產(chǎn)的瘦素放射免疫分析試劑盒測定血清瘦素質(zhì)量濃度，具體參照葉芳艷等[22]的方法。

1.5 內(nèi)臟器官和消化道重量測定

取完血后，進(jìn)行試驗(yàn)動物的解剖，取出心臟、肝臟、脾、肺、腎、BAT以及胃腸道(胃、小腸、盲腸、大腸)等內(nèi)臟器官，用分析天平稱重(±1 mg)。同時稱量胴體重。

1.6 體脂重量測定

參照葉芳艷等[22]采用的索氏抽提法測定。

1.7 肝臟和BAT中的生化指標(biāo)測定

提取肝臟和BAT線粒體蛋白，測定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。TP質(zhì)量分?jǐn)?shù)和MtP質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用Folin-phenol法測定，使用牛血清蛋白作為參照[23]。COX活性和α-PGO活性采用氧電極法測定[24]。

1.8 下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量測定

參照朱萬龍等[25]的研究方法進(jìn)行下丘腦神經(jīng)肽NPY、AgRP、POMC和CART基因表達(dá)量的測定，根據(jù)表1列出的引物進(jìn)行序列擴(kuò)增[26]。

表1 大絨鼠下丘腦神經(jīng)肽Real-Time qPCR基因特異性引物

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同性別的昭通絨鼠的生理指標(biāo)差異不顯著，故合并統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)。體重用單因素方差(one-way ANOVA)分析，食物攝入量、RMR、NST、血清瘦素質(zhì)量濃度、內(nèi)臟器官和消化道重量、體脂、肝臟和BAT中的生化指標(biāo)以及下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量均采用協(xié)方差(ANCOVA)分析，以體重作為協(xié)變量。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏冬季體重、體脂、攝食量和身體組成的差異

昭通絨鼠夏冬季體重分別為(36.58±0.98)、(34.06±0.68)g，差異不顯著(t1，22=0.98，P>0.05)；體脂重夏冬季分別為(3.96±0.53)、(1.12±0.15)g，冬季體脂重顯著低于夏季(t1，22=2.14，P<0.05)。昭通絨鼠夏冬兩季攝食量分別為(3.25±0.63)、(5.69±0.35)g，夏季較低，冬季較高，差異極顯著(t1，22=4.36，P<0.01)。昭通絨鼠胴體重夏季顯著高于冬季；夏冬兩季除肺重、盲腸重和大腸重季節(jié)間差異不顯著外，其余身體組成和消化道重量均出現(xiàn)了季節(jié)性差異，冬季顯著高于夏季(表2)。

表2 昭通絨鼠組織器官的季節(jié)變化

2.2 代謝率和產(chǎn)熱

昭通絨鼠RMR夏冬季差異顯著，分別為(2.80±0.14)、(5.24±0.32)mL/(g·h)(t1，22=1.85，P<0.05)；NST夏冬季差異顯著，分別為(3.98±0.22)、(7.65±0.34)mL/(g·h)(t1，22=2.69，P<0.05)。肝臟和BAT中的TP質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MtP質(zhì)量分?jǐn)?shù)、COX活性和α-PGO活性均出現(xiàn)了季節(jié)性變化，冬季指標(biāo)顯著高于夏季(表3)。

表3 昭通絨鼠肝臟、BAT中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶活性的季節(jié)變化

2.3 瘦素和下丘腦神經(jīng)肽基因相對表達(dá)量

昭通絨鼠血清瘦素質(zhì)量濃度夏季為(4.15±0.33)ng/mL，冬季為(2.58±0.19)ng/mL，二者差異極顯著(t1，22=3.25，P<0.01)。下丘腦神經(jīng)肽基因相對表達(dá)量出現(xiàn)了季節(jié)性變化，NPY和AgRP表達(dá)量冬季顯著高于夏季，夏冬兩季NPY分別為(1.00±0.11)和(1.54±0.14)(t1，22=2.12，P<0.05)，夏冬兩季AgRP分別為(1.00±0.10)和(1.88±0.11)(t1，22=2.68，P<0.05)；POMC和CART表達(dá)量夏季顯著高于冬季，夏冬兩季POMC分別為(1.00±0.10)和(0.41±0.09)(t1，22=-3.21，P<0.01)，夏冬兩季CART分別為(1.00±0.15)和(0.26±0.10)(t1，22=-4.52，P<0.01)。

3 討論

在面對季節(jié)環(huán)境變化時，許多小型哺乳動物會通過調(diào)節(jié)體重變化獲得更多的生存機(jī)會，而這種生存策略具有種屬特異性[2]。例如，中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)在冬季由于受到的低溫脅迫相對較弱，食物資源相對充足，體重高于夏季[27]。長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)由于具有集群貯食行為和不冬眠的現(xiàn)象，體重也是冬季較高，夏季較低[28]。而高山姬鼠和高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)冬季由于能量消耗增加，體重則顯著低于夏季[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)昭通絨鼠體重季節(jié)性差異不顯著，與黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)[2]、非洲刺毛鼠(Acomyscahirinus)[31]體重變化相似，說明昭通絨鼠夏冬季節(jié)體重調(diào)節(jié)符合“調(diào)定點(diǎn)假說”。

動物體重的平衡主要取決于能量攝入和能量消耗之間的平衡[32]。其中，活動水平的強(qiáng)弱是影響小型哺乳動物能量攝入和體重的重要因素[33]。本研究昭通絨鼠在食物資源充足的夏季體重并沒有增加，可能受到昭通地區(qū)晝夜溫較差大的影響，通過減少活動行為來降低能量消耗，確保體重相對穩(wěn)定，同時還能夠降低被捕食的風(fēng)險，提高野外生存率；而在冬季極端低溫和食物資源匱乏的惡劣環(huán)境下，昭通絨鼠采取增加覓食行為促進(jìn)攝食量的策略，彌補(bǔ)機(jī)體能量的散失，維持體重的相對穩(wěn)定以度過不良環(huán)境。體脂重量也參與動物體重的調(diào)節(jié)，能反映動物的營養(yǎng)狀況[34]。昭通絨鼠的體脂重量冬季低于夏季，說明昭通絨鼠在冬季面對低溫和食物資源匱乏的極端環(huán)境時，也需要像高山姬鼠[29]一樣動用體內(nèi)的脂肪彌補(bǔ)自身產(chǎn)熱的支出。此外，動物器官重量的變化可作為動物對外界環(huán)境條件變化的反映[35]。當(dāng)發(fā)生季節(jié)變化時，許多動物的內(nèi)臟器官以及消化道等身體組成會出現(xiàn)相應(yīng)的改變，比如黑線倉鼠冬季的身體組成與夏季相比，肝臟、肺、腎和胃腸道等器官更重[36]。大絨鼠通過增加其小腸、盲腸等器官長度或重量來抵御冬季溫度降低、食物質(zhì)量下降的環(huán)境變化[6]。本研究昭通絨鼠胴體重夏季顯著高于冬季；而身體組成和消化道重量除肺重、盲腸重和大腸重季節(jié)間差異不顯著外，其余器官均是冬季顯著高于夏季，說明昭通絨鼠能通過增加身體組織和器官重量來彌補(bǔ)胴體重的降低，進(jìn)而維持季節(jié)間體重的平衡。

增加能量代謝和產(chǎn)熱是小型哺乳動物應(yīng)對低溫環(huán)境的一種有效策略[37]。例如，暴露于低溫環(huán)境下的黑線倉鼠的代謝率、非顫抖性產(chǎn)熱和BAT中的COX活性顯著增加[38]。莫氏田鼠(Microtusmaximowiczii)的RMR和NST在較冷的月份也出現(xiàn)增加[39]。本研究昭通絨鼠RMR和NST在季節(jié)變化中同樣出現(xiàn)類似的變化趨勢，冬季顯著增加。同時研究還表明，昭通絨鼠冬季的肝臟和BAT中的TP質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MtP質(zhì)量分?jǐn)?shù)、COX活性和α-PGO活性顯著高于夏季。以上結(jié)果表明，昭通絨鼠冬季能夠通過增加能量代謝和產(chǎn)熱調(diào)節(jié)機(jī)體能量的平衡，最終維持體重的季節(jié)性穩(wěn)定，更好地適應(yīng)生存。

瘦素能夠作為一個潛在的肥胖信號，通過與下丘腦中的特定受體結(jié)合，參與調(diào)整動物體重的季節(jié)性變化[40]。研究顯示，瘦素質(zhì)量濃度降低能夠增加動物促食類神經(jīng)肽NPY和AgRP的表達(dá)，增加能量攝入[41]。由此可見，下丘腦神經(jīng)肽在調(diào)節(jié)能量平衡過程中發(fā)揮重要作用[42]。例如，中緬樹鼩在冬季通過增加促食類神經(jīng)肽的表達(dá)量，增加體重以彌補(bǔ)產(chǎn)熱增加，夏季則表現(xiàn)出相反的調(diào)節(jié)機(jī)制[25]。同樣，高山姬鼠面對冬季低溫環(huán)境也能降低瘦素，增加NPY和AgRP的高表達(dá)對體重和能量攝入進(jìn)行調(diào)節(jié)[29]。本研究中昭通絨鼠的血清瘦素質(zhì)量濃度和下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量也出現(xiàn)了類似的季節(jié)性變化，NPY和AgRP表達(dá)量夏季較低、冬季較高，與血清瘦素質(zhì)量濃度變化情況相反；而POMC和CART表達(dá)量則是夏季較高，冬季較低。冬季昭通絨鼠血清瘦素質(zhì)量濃度較低，主要作為一種饑餓信號增加促食類神經(jīng)肽的表達(dá)，促進(jìn)攝食，保持其體重的穩(wěn)定；夏季相對來說食物資源豐富，POMC和CART表達(dá)量增加能夠在一定程度上減少食物攝入，確保昭通絨鼠的體重維持在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)。

綜上所述，昭通絨鼠夏冬季節(jié)的體重變化符合“調(diào)定點(diǎn)假說”，其在冬季主要通過降低體脂重量，增加攝食量、代謝產(chǎn)熱以及內(nèi)臟器官和消化道重量來適應(yīng)季節(jié)環(huán)境的變化。