任俊 曹躍炫 黃勇 董慧榮 劉慶 王克劍

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；#共同第一作者：82101172206@caas.cn；*通訊作者：wangkejian@caas.cn）

水稻是世界上的主要糧食作物之一，全球大約一半以上的人口以大米為主食[1]。然而，傳統(tǒng)育種策略周期長，人力、物力投入多，嚴重限制了水稻新品種的開發(fā)。序列特異性核酸酶（Sequence specific nucleases,SSNs）的出現(xiàn)則大大加快了育種進程，其可以精確地靶向基因組的特定位點。到目前為止，主要的序列特異性核酸酶包括：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases, ZFNs）[2]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）[3]，以及成簇的規(guī)律性間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat -associated protein，CRISPR/Cas）[4]。科學家們在對細菌的免疫系統(tǒng)及作用機理有了較深的認識后，開始對系統(tǒng)進行改造并逐步應用到動植物上。其中，CRISPR/Cas 系統(tǒng)因其設計和構建簡單、成本低、突變效率高等特點被廣泛應用。因此，本文也主要就CRISPR/Cas 系統(tǒng)在水稻中的發(fā)展和應用來進行綜述討論。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)介紹

1.1 依賴DSB 的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是普遍存在于古細菌及原核生物細菌的一種獲得性免疫機制[5]，可以在1 個引導RNA（single guide RNA, sgRNA）的引導下特異性地識別外源DNA 或RNA，并對其進行切割以達到沉默外源基因的目的。目前，在水稻中使用最多的是Type II型的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)[6-7]，該系統(tǒng)僅需 1 個 Cas9 蛋白和sgRNA 元件參與，機制相對簡單。在sgRNA 的引導下，Cas9 蛋白靶向基因組特定位置，并且其2 個核酸酶結構域RuvC 和HNH 分別切割基因組的靶標鏈（target strand）和非靶標鏈（non-target strand），產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（Double strand break，DSB），進而誘發(fā)細胞內(nèi)非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源重組（homologous recombination, HR）修復途徑，實現(xiàn)對基因組序列的插入缺失（insertions/deletions, indel）、替換等精準修飾[8]（圖1a）。然而CRISPR/Cas 系統(tǒng)中靶位點的選取受限于一段短的前間隔臨近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）序列[4]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)特異性識別 3’端一段 NRG（R=A/G））PAM 序列[6,9]。

圖1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)及衍生技術的工作模式

另一個使用廣泛的是Type V 型的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)（也叫CRISPR/Cpf1），其特異性識別5’端連續(xù)2個或3 個胸腺嘧啶（T）的 PAM 序列[10-11]。并且與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas12a[12]系統(tǒng)只需在crRNA（CRISPR RNA）引導下即可對DNA 雙鏈進行切割，無需反式激活crRNA（trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA） 參與；Cpf1 的 crRNA 較 sgRNA 更短，且其蛋白也比Cas9 蛋白更小，有助于構建裝載量小和多基因編輯的載體；Cas9 蛋白切割基因組產(chǎn)生平末端，而Cas12a 切割目標序列產(chǎn)生粘性末端。Cas9 和Cas12a均是靶向 DNA 序列，而 VI 型CRISPR/Cas 效應體Cas13a（亦稱 C2c2）[13]在一個 crRNA 引導下，可以切割與crRNA 互補配對的RNA 靶標。并且C2c2 還具有臨近效應（collateral effect），即當 C2c2 特異性靶向 RNA靶標時，也會切割臨近的RNA 單鏈。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)靶向基因組受限于一段短的PAM 序列，通過開發(fā)SpCas9 蛋白的同源蛋白，例如SaCas9（NNGRRT PAM）[14]、ScCas9（NNG PAM）[15]；以及人工改造變體，如 VQR（NGA PAM）[16-17]、VRER（NGCG PAM）[17]、xCas9 （NG, GAA 和 GTA PAM）[18-19]、SpCas9-NG（NG PAM）[18,20-21]、SpG（NG PAM）[22-23]等，CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯范圍獲得了極大地拓展，甚至幾乎沒有PAM 序列的限制，如 SpRY 變體[22-23]。

1.2 不依賴DSB 的CRISPR/Cas 系統(tǒng)

1.2.1 堿基編輯器

除DSB 介導的基因編輯外，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)展起來的堿基編輯技術成為動植物精準基因修飾的重要支撐。目前水稻中常用的堿基編輯系統(tǒng)主要有兩類：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor, CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor, ABE）（圖 1b）。這兩類堿基編輯系統(tǒng)利用胞嘧啶脫氨酶或人工進化的腺嘌呤脫氨酶與Cas9 缺口酶（nicking Cas9, nCas9）進行融合，融合蛋白在sgRNA 介導下對靶位點進行精準的堿基編輯，最終可以分別實現(xiàn)C-T（G-A）或A-G（TC）的堿基轉(zhuǎn)換[24-31]。雖然CBEs 和ABEs 能夠精確的實現(xiàn)基因組編輯，但是，這兩種堿基編輯器只能實現(xiàn)嘧啶對嘧啶、嘌呤對嘌呤的轉(zhuǎn)換，即C-T、T-C、G-A 和A-G的改變，而不能實現(xiàn)堿基之間的顛換，如C-G、C-A、AT 和A-C 的轉(zhuǎn)變。最近，有研究報道了一種能同時編輯C 和A 兩種堿基的雙堿基編輯器，它是由nCas9（D10A）與胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶融合而成，能同時使C-G 和A-T 轉(zhuǎn)變?yōu)門-A 和G-C[32-33]。雙堿基編輯器的開發(fā)能夠進一步實現(xiàn)復雜的堿基編輯，解決了同時表達兩個單堿基編輯器效率低的問題，也進一步拓寬了堿基編輯器的功能。

1.2.2 引導編輯器

為了實現(xiàn)堿基間的任意顛換和短片段的精準插入和缺失，ANZALONE 等[34]開發(fā)了引導編輯器（prime editors，Pes），可以實現(xiàn)全部12 種類別的堿基替換和小片段的插入缺失突變。PEs 系統(tǒng)由nSpCas9（H840A）、pegRNA（prime editing extended guide RNA）和逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV（moloney murine leukemia virus reverse transcriptase）組成，其中 pegRNA 是在 gRNA 序列的 3’末端添加引物結合位點（prime binding sites，PBS）和攜帶編輯信息的逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription, RT）模板（圖1c）。PEs 系統(tǒng)的主要工作機制是：nSpCas9（H840A）與工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 的融合蛋白在pegRNA 的引導下在非靶標鏈上引入切口，切口的末端與pegRNA 上的 PBS 結合并在與 nSpCas9（H840A）蛋白融合表達的逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將pegRNA 的RT 模板攜帶的編輯信息直接反轉(zhuǎn)錄到目標DNA 鏈上，隨后在生物體內(nèi)的修復機制的作用下，將編輯信息引入基因組上。nSpCas9 在非編輯鏈上引入第二切口，誘導細胞以編輯鏈為模板對非編輯鏈進行修復，可以進一步提高對靶位點的精準編輯效率。目前，PEs 已經(jīng)被成功應用于水稻中[35-38]，但是由于PEs 的編輯效率受到細胞類型、Cas9 活性以及 pegRNA 等多種因素的影響[39-42]，故其在植物中的編輯效率偏低且不穩(wěn)定，但是PEs 可以實現(xiàn)其他編輯工具無法實現(xiàn)的多種精準突變，因此需要進一步的優(yōu)化和探索PEs 系統(tǒng)。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在水稻品種改良和分子育種中的應用

多種基因編輯體系，包括堿基編輯器、引導編輯等的相繼建立，為作物功能基因組研究和品種改良提供了強大的理論基礎和技術支撐，可以迅速地在1~2 代內(nèi)獲得穩(wěn)定的性狀改良的水稻材料（圖2）。

圖2 傳統(tǒng)育種與基因編輯育種技術比較

2.1 提高水稻產(chǎn)量

水稻是100 多個國家和地區(qū)30 多億人的主要糧食[43]。隨著世界人口的急劇增長和生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，全球糧食的可持續(xù)穩(wěn)定供應面臨巨大的風險，進一步提高水稻產(chǎn)量，保障糧食安全刻不容緩。水稻產(chǎn)量主要由有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重決定。近年來利用基因編輯技術已經(jīng)改善了大量與產(chǎn)量性狀相關的調(diào)控基因。

近幾十年來，水稻中的主效粒形數(shù)量性狀基因（quantitative trait locus，QTL）已經(jīng)相繼被克隆[44-53]，并且通過基因編輯技術靶向這些QTLs 對水稻粒形產(chǎn)生了一定影響。例如，通過CRISPR/Cas9 介導的多重基因組編輯技術，同時編輯日本晴中2 個粒形調(diào)控因子GS3和GL3.1，gs3 突變體的T1代種子籽粒較細，而gs3gl3.1雙突變體產(chǎn)生的籽粒較大[54]。此外，對另一個調(diào)控水稻千粒重的基因TGW6 進行敲除，獲得的純合突變株系的種子粒長粒重增加，水稻千粒重提高約5%[48]。利用CRISPR/Cas9 技術靶向每穗粒數(shù)主效基因OsGn1a，其純和突變株系的每穗粒數(shù)增加，單株產(chǎn)量增加[7]。在OsTB1 的多種突變類型中，TGTG 插入的株系，株高、穗長、穗粒數(shù)均比野生型十分顯著的增加，同時莖稈變粗而且抗折[55]。LV 等[56]利用 CRISPR/Cas9 技術敲除OsPAO5，顯著增加了水稻籽粒大小、提高水稻產(chǎn)量，同時也顯著地促進了水稻中胚軸伸長，可以促進水稻直播出苗。MIAO 等[57]利用CRISPR/Cas9 靶向一個影響粒型和株型的關鍵調(diào)控因子miR396。在其所有的突變體中，mir396e/f 突變體的籽粒長度和寬度明顯增加，穗長和穗分支數(shù)目增加。并且mir396e/f 突變體還可以提高植物體的耐低氮逆境脅迫，在低氮條件下仍表現(xiàn)出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特性。

在干旱脅迫下，脫落酸（ABA）可以促進根系的生長，但是整體上ABA 對植物的生長具有抑制作用[58]。利用CRISPR/Cas9 靶向ABA 受體蛋白家族成員PYL[pyrabactin resistance 1（PYR1）/PYR1-like]發(fā)現(xiàn) pyl1/4/6 突變體在自然水田條件下水稻長勢最好，并且產(chǎn)量提高，同時保持正常的種子休眠[59]。

2.2 改善稻米品質(zhì)

稻米品質(zhì)主要包括加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮和食用品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和衛(wèi)生品質(zhì)等幾個方面[60]。其中稻米外觀品質(zhì)在很大程度上影響了市場的接受度，稻米堊白是衡量稻米品質(zhì)的一個重要性狀，堊白率高的稻米會嚴重影響其外觀品質(zhì)和人們的食用烹調(diào)，因此，堊白率高的水稻品種在市場的接受度很小。近年來，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)生成的純合gs9 （Grain Shape Gene on Chromosome 9）無義突變體的籽粒堊白率顯著降低，并且粒形較野生型細長，但是千粒重與野生型沒有明顯差異[61]。

水稻食用和蒸煮品質(zhì)（eating and cooking quality，ECQ）主要由直鏈淀粉含量（amylose content，AC）、凝膠稠度和糊化溫度決定，其中AC 是ECQ 最重要的決定因素[62]。蠟質(zhì)（Waxy、Wx）基因決定了水稻 AC 含量，該基因編碼顆粒結合淀粉合成酶I（granule-bound starch synthase I），控制胚乳中直鏈淀粉的合成[63-64]。近幾十年來，在Wx 位點發(fā)現(xiàn)的多個等位基因（如Wxlv、Wxa、Wxb、Wxin、Wxop/hp、Wxmp、Wxmq、Wxmw和 wx）在不同程度上影響了水稻AC 含量，并進一步增加了消費者的選擇。FEI 等[65]用 CRISPR/Cas9 技術對水稻W(wǎng)x 基因進行敲除，培育出了優(yōu)良的糯稻品種，其AC 含量降到僅為2.6%~3.2%，而稻米其他品質(zhì)無明顯變化。除了直接敲除Wx 基因改良稻米品質(zhì)外，也有多個研究團隊采用了不同的策略編輯Wx 基因，獲得了不同AC 含量的新軟米種質(zhì)資源。XU 等[66]利用CBE 單堿基編輯器對水稻品種日本晴Wxb基因N 端結構域進行功能位點突變，獲得了AC 含量分布在1.4%~11.9%的水稻新種質(zhì)。HUANG 等[67]利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對 Wxb啟動子TATA box 區(qū)域進行編輯，AC 含量從野生型的16.80%下降到10.66%~14.85%。ZENG 等[68]則利用CRISPR/Cas9 對Wxa啟動子區(qū)及其5’UTR 內(nèi)含子剪接點進行編輯，AC 含量分別下降到 17.0%~18.0%和 9.0%~10.0%。

香稻品種因其獨特的香氣和口感而越來越受歡迎。香稻中香味的主要成分是2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），而它的合成前體4-氨基丁醛主要被OsBADH2 蛋白氧化失活[69]。利用CRISPR/Cas9技術獲得OsBADH2 的功能缺失突變體，其2AP 積累增加，水稻香味增強[70-71]。通過編輯OsBADH2 外顯子和內(nèi)含子交接處而引起外顯子的跳躍，從而導致了其閱讀框的移位也得到了類似的結果[72]。

2.3 增強對生物脅迫的抗性

植物病原菌和害蟲對糧食安全構成嚴重威脅，據(jù)估計，它們每年造成20%~40%的全球糧食生產(chǎn)損失[73]。利用CRISPR/Cas 技術敲除病蟲害易感基因可以減少病蟲害對水稻發(fā)育和產(chǎn)量的影響。

水稻白葉枯病和稻瘟病是稻作生產(chǎn)中的主要病害，會直接影響水稻產(chǎn)量，一般減產(chǎn)10%~20%，嚴重的達40%~50%，局部田塊甚至顆粒無收[74]。水稻白葉枯病是由水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的。目前對白葉枯病具有廣譜抗性的水稻品種就是通過編輯SWEET 基因啟動子區(qū)域降低其表達而獲得的[75]。相同的策略也編輯了白葉枯病抗性基因Xa13，從而提高了水稻白葉枯病抗性[76]。稻瘟病是由稻瘟病原菌引起的。WANG 等[77]在水稻中靶向OsERF922基因，提高了水稻對稻瘟病的抵抗能力。同樣，通過CRISPR/Cas9 靶向誘變獲得的 OsSEC3A、Pi21 基因的突變體植株，對稻瘟病的抗性也得到一定增強[78-79]。

相較于水稻抗病種質(zhì)的突破性研究進展，基因編輯技術在抗蟲方面的研究進展較為緩慢，這可能與水稻害蟲抗性機制更為復雜有關，只有少數(shù)的抗蟲基因被克隆。并且，已克隆的褐飛虱抗性基因BPHs 正向調(diào)控水稻對褐飛虱的抗性，并不能簡單的利用CRISPR/Cas 技術獲取功能缺失突變體來增強水稻對褐飛虱的抗性。

2.4 增強對非生物脅迫的抗性

近年來，氣候的不斷惡化使水稻生長面臨越來越嚴重的逆境脅迫。雜草、重金屬污染、干旱等逆境脅迫越來越嚴重，培育抗逆性強的水稻品種越來越迫切。

雜草危害是制約水稻生產(chǎn)的重要因素。除草劑的使用雖然在很大程度上可以抑制雜草的生長，但是也會對水稻生長和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定影響，不適宜直接用于實際生產(chǎn)[80]。因此培育除草劑抗性增強的水稻不僅可以提高除草效率，節(jié)約大量人力成本，還可以更好地保護生物穩(wěn)態(tài)。SUN 等[81]利用CRISPR/Cas9 介導的同源重組修復技術將W548L 和S627I 這2 個氨基酸替換，成功引入水稻ALS 基因，獲得了耐碘酰脲類和嘧啶羧酸類除草劑水稻新種質(zhì)。此外，EPSPS 蛋白的T102I 和 P106S 氨基酸突變[82]以及 TubA2 中的 M268T[83]突變，分別賦予水稻對草甘膦和氟樂靈的抗性。綜上所述，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)產(chǎn)生的這些抗除草劑等位基因具有加速水稻種質(zhì)創(chuàng)新的巨大潛力。

隨著工業(yè)化進程的不斷發(fā)展，重金屬污染也逐漸加劇。其中鎘是一種毒性很大的重金屬，且可在生物體內(nèi)富集。因此，利用CRISPR/Cas9 技術敲除鎘攝取相關蛋白（OsNramp5）和鎘轉(zhuǎn)運蛋白（OsLCT1）可以減少鎘在水稻中的積累[84]。

鹽脅迫是影響植物生長非常重要的非生物脅迫因素。目前的研究表明，主要是一些植物轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與響應鹽脅迫反應[85]。利用CRISPR/Cas9 技術敲除NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子OsNAC041，敲除后植株高度高于野生型并且突變體鹽敏感性增加[86]。

2.5 單倍體育種和無融合生殖

1987 年，袁隆平先生提出雜交水稻育種分三個發(fā)展階段的戰(zhàn)略：從“三系法”到“兩系法”再到“一系法”，朝著程序由繁到簡而效率越來越高的方向發(fā)展[87]。水稻育種“一系法”即以無融合生殖為遺傳基礎的雜種優(yōu)勢固定的育種研究。無融合生殖（Apomixis）是一種通過種子進行無性繁殖的生殖方式，由于其不經(jīng)過減數(shù)分裂或受精就可以產(chǎn)生種子，因此不會改變雜交品種的雜合基因型，從而實現(xiàn)雜種優(yōu)勢的固定[88]。雖然無融合生殖在400 多個物種中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是在一些主要農(nóng)作物中并沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[89]。

近期，有研究表明，精細胞特異表達基因OsBBM1在卵細胞中異位表達可以繞過受精過程產(chǎn)生孤雌生殖，獲得單倍體[90]。并且此前有研究報道，利用CRISPR/Cas9 技術同時敲除3 個將減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換為有絲分裂（Mitosis instead of Meiosis，MiMe） 的相 關基因（O－sPAIR1、OsREC8、OsOSD1），可以消除水稻中的重組事件，使卵細胞加倍[91]。因此，在水稻中同時敲除MiMe 相關基因，并且利用卵細胞特異表達基因的啟動子驅(qū)動OsBBM1 在卵細胞異位表達，就可以使二倍體卵細胞直接發(fā)育成胚進而完成無融合生殖過程[90]。

幾乎同時，WANG 等[92]利用基因編輯技術同時編輯 4 個基因（OsPAIR1、OsREC8、OsOSD1、OsMTL），將無融合生殖特性引入到雜交稻中，獲得了雜種優(yōu)勢固定的克隆種子。前期研究表明，玉米MTL 基因的無義突變可以誘導產(chǎn)生單倍體[93-94]。WANG 等[92]首先利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術敲除了秈粳雜交稻品種春優(yōu)84 中與玉米MTL 同源的OsMTL 基因，在其F1代成功產(chǎn)生了水稻單倍體。隨后繼續(xù)利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術在春優(yōu)84 中同時敲除MiMe 相關基因和OsMTL 共4 個水稻內(nèi)源基因，獲得了可以發(fā)生無融合生殖的雜種優(yōu)勢固定（Fixation of hybrids, Fix）材料。Fix植株在營養(yǎng)生長階段表現(xiàn)正常，表型也與其F1代雜交稻高度相似。但是上述兩種策略單倍體誘導率均較低（5%左右），并且育性也明顯下降（10%左右），還不能完全投入實際生產(chǎn)應用。

2.6 人工定向進化

遺傳和變異是生物進化的基礎。長期以來，研究人員通過物理（例如紫外線）或化學（例如乙基磺酸乙酯，EMS）等方法來創(chuàng)制突變體，進一步改善植物性狀。但是這些方法產(chǎn)生的突變是隨機的，并且往往會產(chǎn)生大量的植株生長或者某種性狀受到抑制的突變體，后續(xù)對這些突變體的篩選和鑒定非常耗時耗力?；贑RISPR/Cas 技術的高效性和特異性，研究人員通過創(chuàng)制目標基因的突變文庫，并在相應選擇壓力下，可以快速且定向獲得目標性狀改良的作物品種。

LI 等[33]設計了200 個獨立的sgRNA 靶向水稻乙酰輔酶A 羧化酶（OsACCase）的羧基轉(zhuǎn)移酶結構域（Carboxyltransferase, CT domain）。隨后對再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）進行篩選，對長勢正常的秧苗進行測序以確定突變類型，共發(fā)現(xiàn)4 個除草劑抗性突變 位 點 ：P1927F、W2125C、S1866F 和 A1884P。 除W2125C 以外，其余3 個抗性位點未曾在植物中有過報道。另外兩個研究團隊也利用類似的策略分別對水稻ACCase 的CT domain[95]及內(nèi)源靶標基因OsALS[96]實現(xiàn)近似飽和突變，均發(fā)現(xiàn)一些新的有生產(chǎn)應用潛能的除草劑抗性位點，并且研究人員[96]進一步將鑒定到的OsALS 中的P171F 氨基酸替換引入到了水稻生產(chǎn)品種南粳46 中，使南粳46 升級為“潔田稻”。

2.7 野生稻從頭馴化

當前種植的所有栽培稻都是經(jīng)過數(shù)千年的時間從野生稻馴化而來的。隨著時間的推移，在提高作物產(chǎn)量和獲得理想性狀的同時，也導致了遺傳多樣性的減少以及一些抗逆性的減弱。許多主要作物的野生近親比栽培作物對生物和非生物脅迫的抗性更強，因此野生植物的直接馴化是一個非常有前景的策略[97]。YU 等[98]利用CRISPR/Cas 技術首次建立了野生四倍體水稻快速從頭馴化的技術體系，并進一步利用基因編輯技術對異源四倍體水稻基因組與二倍體栽培稻中重要農(nóng)藝性狀的同源基因進行編輯，成功創(chuàng)制了一系列具有不同表型的突變體，為創(chuàng)制和培育新的作物以滿足未來的糧食需求和安全提供了一個切實可行的策略。

3 討論

截至2021 年1 月，全球230 個國家人口總數(shù)為75.85 億。聯(lián)合國最新發(fā)布的《世界人口展望：2015 年修訂版》報告預計，世界人口將在2050 年達到97 億，2100 年達到112 億。面對如此急劇增長的人口數(shù)量和人口壓力，如何能夠保證未來的糧食生產(chǎn)和安全是我們現(xiàn)在面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。并且隨著全球氣候環(huán)境不斷惡化、耕地資源不斷縮小等，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和可持續(xù)利用帶來了更大壓力。因此，迫切需要科技創(chuàng)新來進行作物的性狀改善和品種改良，來適應不斷惡化的自然環(huán)境。

植物基因組編輯技術的發(fā)展為植物育種提供了很大的便利。通過基因組編輯的高效和精確的誘變可以在1~2 代內(nèi)獲得性狀穩(wěn)定的作物種質(zhì)，這是傳統(tǒng)育種技術無可比擬的。同時，基因編輯技術也存在兩方面的限制。一是其編輯范圍受限制，雖然目前CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯范圍已經(jīng)獲得極大拓展，甚至于幾乎不受PAM 的限制，但是SpRY 變體對PAM 的識別具有偏好性，即 NRN>NYN（Y=C/T），在攜帶 NYN PAM 的靶位點的編輯活性較低，還需要進一步的優(yōu)化，使其在這些靶位點的編輯效率都得到進一步提高。另一方面是其突變類型受限制，雖然現(xiàn)在CRISPR/Cas 系統(tǒng)已可以獲得多種類型的突變，如基因功能喪失、基因氨基酸替換以及調(diào)控基因表達等。但是這些類型的突變均是通過CRISPR/Cas 系統(tǒng)不同類型的衍生技術來實現(xiàn)，不同類型的突變不能通過一種類型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)同時獲得。PE 系統(tǒng)的出現(xiàn)打破了這些衍生技術之間的鴻溝，其可以產(chǎn)生插入缺失突變以及全部12 種類型的堿基替換，但是其在植物中的編輯效率很低，不能滿足基礎研究和實際應用的需求。近日，LIN 等[99]通過調(diào)整PBS 的熔解溫度（Melting Temperature, Tm）為 30℃以及在DNA 位點的正負鏈上各設計1 個pegRNA，將PEs系統(tǒng)的編輯效率平均提高約3 倍。并且其還發(fā)現(xiàn)PE 系統(tǒng)在全基因組范圍內(nèi)具有很高的特異性。進一步將SpRY 變體與PEs 系統(tǒng)相結合，可以使CRISPR/Cas 系統(tǒng)獲得極大拓展，為植物品質(zhì)改良和分子育種提供更簡捷高效的工具。

基因編輯技術可以特異地將多個遺傳性狀組合，從而精確高效地獲得多個性狀同時改良的作物種質(zhì)。并且還可以通過設計多個gRNA 同時靶向一個基因，在后期的選擇壓存在的條件下加速作物的馴化進程。利用基因編輯技術實現(xiàn)了植物的無融合生殖構成，成功實現(xiàn)了雜種優(yōu)勢的固定，避免了繁瑣的雜交種制種流程，節(jié)省了大量人力物力，減少了農(nóng)民的種植成本。當前，針對基因編輯產(chǎn)品的安全性問題世界各國的態(tài)度也存在一定差別。除了歐盟中部分國家將基因編輯作物視為轉(zhuǎn)基因作物，受轉(zhuǎn)基因生物管理條例規(guī)定的約束外，大多數(shù)國家，如美國、加拿大、澳大利亞、日本、阿根廷、巴西等已將基因編輯（沒有導入外源基因）作物視為非轉(zhuǎn)基因生物，開放了基因編輯產(chǎn)品流入市場。近期開發(fā)的一種外源成分檢測器（Foreign Element Detector, FED）可在外源成分信息未知的情況下，對全基因組重測序數(shù)據(jù)進行分析，一次性完成對46 695 種不同外源成分序列的檢測，同時FED 還可以精確鑒定出外源成分的片段長度及在基因組上的插入位置，為全球基因組編輯產(chǎn)品的應用和安全監(jiān)管提供了一個重要工具平臺[100]。同時也有望為我國基因編輯產(chǎn)品的開發(fā)和應用提供安全保障，將基因編輯技術研發(fā)的領先優(yōu)勢盡快地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品優(yōu)勢，以有效應對外來基因編輯產(chǎn)品的沖擊，保障國家糧食安全。