許鑫 吳堅(jiān)玲 洪建利 戴新斌

冠心病已成為全球性的健康問題[1]。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織全球疾病評(píng)估報(bào)告，在過去10年中，心血管疾病是主要的死亡原因[2]。糖尿病合并冠心病是患者死亡的重要危險(xiǎn)因素[3]。我國中草藥已有數(shù)千年的臨床應(yīng)用史，積累了大量的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并總結(jié)了諸多有效的經(jīng)典方。中醫(yī)經(jīng)方芎歸湯由當(dāng)歸和川芎兩味中藥組成。川芎和當(dāng)歸作為中藥常見的藥物組合，常用于冠心病、糖尿病等疾病的治療[4-5]。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興的交叉科學(xué)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用取得了較大進(jìn)展。其通過高通量組學(xué)分析、計(jì)算機(jī)技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索等方法，將中醫(yī)方劑研究與網(wǎng)絡(luò)科學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合，從系統(tǒng)角度和分子水平研究中醫(yī)方劑的治療機(jī)制[6]，符合中醫(yī)學(xué)整體觀念的思想[7]。同時(shí)，為中醫(yī)學(xué)從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)向循證醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化提供了一種新的研究范式[8]。本文擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的潛在機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 芎歸湯化學(xué)成分與靶點(diǎn)獲取 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[9]，分別查找當(dāng)歸、川芎的主要化合物、TCMSP identification（TCMSP ID）、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL）信息，并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，獲取芎歸湯活性成分及其潛在靶點(diǎn)。再將篩選出的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 糖尿病合并冠心病的靶點(diǎn)獲取 在GeneCards、OMIM、PharmGKB、Therapeutic target database[10]和DrugBank 5個(gè)數(shù)據(jù)庫中，分別以diabetes mellitus和coronary heart disease為關(guān)鍵詞，檢索糖尿病合并冠心病的靶點(diǎn)。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用venny 2.1在線工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到的潛在靶點(diǎn)與糖尿病合并冠心病靶點(diǎn)作交集，獲取芎歸湯干預(yù)糖尿病合并冠心病患者的潛在靶點(diǎn)。將藥物化合物以及潛在靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中，以不同形狀的節(jié)點(diǎn)表示藥物、成分、靶點(diǎn)和疾病，節(jié)點(diǎn)間的連線表明兩者間存在相互作用關(guān)系。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將得到的芎歸湯干預(yù)糖尿病合并冠心病的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 11.0[11]，物種選擇為homo sapiens，設(shè)定相互作用閾值置信度＞0.15，并隱藏?zé)o互作關(guān)系的靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白-蛋白作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。然后，將數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，借助CytoNCA插件進(jìn)行核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選[12]。

1.5 基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用R語言clusterProfiler包[13]對(duì)芎歸湯、糖尿病合并冠心病的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。以q值＜0.05為篩選條件，按q值大小，將前10的GO生物過程和前30的KEGG通路可視化。

2 結(jié)果

2.1 芎歸湯活性成分 見表1。

表1 芎歸湯的活性成分

由表1可見，得到9種活性化學(xué)成分。其中，川芎7種，當(dāng)歸2種。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到潛在靶點(diǎn)69個(gè)。

2.2 糖尿病合并冠心病的靶點(diǎn)篩選 見圖1。

由圖1可見，將芎歸湯活性成分的潛在靶點(diǎn)與糖尿病合并冠心病的疾病靶點(diǎn)取交集，得到芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的潛在靶點(diǎn)21個(gè)：PTGS1、PTGS2、F2、AR、SCN5A、PPARG、F7、KDR、RXRA、ADRB2、NR3C1、PIK3CG、HTR2A、SLC6A4、OPRM1、BAX、CASP3、TGFB1、PON1、ADH1C、ADRB1。

圖1 芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 見圖2。

由圖2可見，芎歸湯通過川芎萘呋內(nèi)酯等7種藥物成分，作用于PTGS1等21個(gè)潛在靶點(diǎn)發(fā)揮治療糖尿病合并冠心病的療效。

圖2 芎歸湯成分-靶點(diǎn)-疾病作用網(wǎng)絡(luò)圖（六邊形節(jié)點(diǎn)代表芎歸湯，菱形節(jié)點(diǎn)代表疾病，矩形節(jié)點(diǎn)代表芎歸湯包含的活性成分，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)）

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 見圖3-4。

由圖3可見，該網(wǎng)絡(luò)包含21個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白，122條相互作用連線，平均節(jié)點(diǎn)度為11.6。

圖3 芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的蛋白-蛋白作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條多寡代表作用強(qiáng)弱）

由圖4可見，PPARG、TGFB1、AR、ADRB2、SLC6A4、PTGS2、PTGS1和CASP3這8個(gè)靶蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。

圖4 芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能分析結(jié)果 見圖5。

圖5 基因本體論（GO）富集分析結(jié)果

由圖5可見，GO富集分析共得到生物過程1 176個(gè)，細(xì)胞成分24個(gè)，分子功能108個(gè)，合計(jì)GO條目1 308個(gè)。分別篩選生物過程、細(xì)胞成分、分子功能前10位的GO條目繪制成氣泡圖。主要涉及的GO條目包括循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、調(diào)節(jié)血壓、脂肪細(xì)胞分化、急性炎癥反應(yīng)、一氧化氮-氧化物合酶結(jié)合和腎上腺素能受體活性等。

2.6 KEGG通路分析結(jié)果 見圖6。

圖6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析結(jié)果（AGE-RAGE為晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；cGMP為環(huán)磷酸鳥苷酸；PKG為環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶；VEGF為人血管內(nèi)皮生長因子）

由圖6可見，神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、5-羥色胺信號(hào)通路、腎上腺素能信號(hào)通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end prod ucts-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信號(hào)通路、血小板活化、環(huán)磷酸鳥苷酸-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶（cGMP-PKG）信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、人血管內(nèi)皮生因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）信號(hào)通路、花生四烯酸代謝等信號(hào)通路在芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國心血管病患者已超2.9億人，其中罹患冠心病患者人數(shù)達(dá)到了1 100萬人，并以每年20%的速度遞增[14]。許多危險(xiǎn)因素導(dǎo)致冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加，包括糖尿病、高血壓疾病和高脂血癥等[15]，嚴(yán)重影響患者的生存狀態(tài)[16]。其中，糖尿病是冠心病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。冠心病在糖尿病人群中的發(fā)病率是非糖尿病人群的2～4倍[17]。川芎的有效成分主要包括苯酞類化合物、生物堿類、多糖、有機(jī)酸及其酯、萜類及其烯醇等[18]，常用于活血行氣，祛風(fēng)止痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川芎具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗菌、抗增殖和促凋亡活性等作用[19]，是臨床上常使用的心血管保護(hù)中藥之一，也是治療動(dòng)脈粥樣硬化的處方中廣泛使用的藥物[20]。當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止血、潤腸通便的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、平喘、鎮(zhèn)痛、抗抑郁和保護(hù)缺血損傷細(xì)胞等作用[21]。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，本研究從芎歸湯的活性化合物、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路等多角度、多途徑預(yù)測(cè)了其治療糖尿病合并冠心病的潛在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，十八碳二烯-[9，12]-酸乙酯、楊梅酮、黑麥草堿、洋川芎醌、川芎萘呋內(nèi)酯、谷甾醇、脂肪酸、β-谷甾醇、豆甾醇等多種成分均是芎歸湯發(fā)揮療效的主要活性成分。證據(jù)表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者表現(xiàn)出膽固醇合成增加的現(xiàn)象[22]?？梢姡悄虿』颊呖赡軙?huì)增加自身膽固醇的合成，繼而引發(fā)心血管疾病。研究表明，β-谷甾醇與體重指數(shù)、空腹胰島素及C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)，與高密度脂蛋白膽固醇呈正相關(guān)[22]。其具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗糖尿病的作用[23]。β-谷甾醇還可通過增加過氧化物酶體增殖物激活受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)來改善胰島素抵抗，以此增強(qiáng)血糖的控制[24-25]。豆甾醇是一種常見的具有抗動(dòng)脈粥樣硬化潛力的植物甾醇[26]?？诜o予小鼠豆甾醇可顯著地減輕其胰島素抵抗和口服葡萄糖耐量，同時(shí)降低空腹血糖水平和血脂指數(shù)，并促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)，對(duì)2型糖尿病的治療具有潛在的有益作用[27]。

KEGG通路分析表明，芎歸湯可能主要通過5-羥色胺信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等發(fā)揮治療作用。研究表明，5-羥色胺信號(hào)參與非糖尿病個(gè)體胰島素分泌的調(diào)節(jié)，HTR1D和HTR2A的過度表達(dá)可能導(dǎo)致2型糖尿病個(gè)體胰島功能的障礙或由于已經(jīng)出現(xiàn)功能失調(diào)的胰島而表現(xiàn)為過表達(dá)[28]。相應(yīng)地，有學(xué)者應(yīng)用選擇性5-羥色胺受體拮抗劑（沙格雷酯）治療冠狀動(dòng)脈狹窄的糖尿病患者，發(fā)現(xiàn)沙普格雷酯治療可減少糖尿病患者的冠狀動(dòng)脈斑塊體積，特別是未鈣化的部分[29]。晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end product，AGE）的積累在體內(nèi)自然發(fā)生，但在糖尿病患者體內(nèi)加速累積[30]。AGE可通過激活其受體RAGE引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[31]。級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活時(shí)，AGE-RAGE級(jí)聯(lián)刺激生長因子分泌并增加膠原產(chǎn)生同時(shí)上調(diào)細(xì)胞膜上RAGE的表達(dá)[32]。由于AGE-RAGE信號(hào)通路的激活導(dǎo)致的細(xì)胞彈性喪失影響許多組織和器官的生理功能。例如，研究表明，AGE-RAGE信號(hào)可通過影響2型糖尿病小鼠冠狀動(dòng)脈血管舒張而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[33]。當(dāng)激活時(shí)，AGE-RAGE級(jí)聯(lián)隨后刺激心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，使得細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加或纖維化，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)展，例如通常在糖尿病患者中觀察到的左心室僵硬[32]。因此，糖尿病患者罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，這被認(rèn)為部分是由于AGE-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化所致[34]。此外，研究表明，鈣離子信號(hào)通路對(duì)胰島β細(xì)胞能否正常發(fā)揮釋放適當(dāng)胰島素的功能至關(guān)重要[35-36]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，較系統(tǒng)地分析了芎歸湯治療糖尿病合并冠心病的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的潛在機(jī)制，為經(jīng)典方的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，本研究尚存在一些不足之處。本研究僅在分子機(jī)制上進(jìn)行了潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，對(duì)于何種成分以何種方式作用于具體靶基因及各通路調(diào)節(jié)機(jī)制等尚需進(jìn)一步開展試驗(yàn)驗(yàn)證。部分生物利用度較低的藥物成分可能通過其他途徑，如腸道菌群，發(fā)揮療效機(jī)制。因此，本研究可能未能完全闡釋芎歸湯發(fā)揮療效的機(jī)制，未來尚需進(jìn)一步研究。