梁浩 錢璽丞 杜曉靜 郁建生

摘要：為研究羥丙基-β-環(huán)糊精對白屈菜紅堿的包合作用，對影響白屈菜紅堿包合率的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比、包合溫度、包合時間等3個因子進行研究。在單因素基礎上，通過Box-Behnken響應面法的3因素3水平進行試驗設計，以白屈菜紅堿包合率為響應值，優(yōu)化包合工藝。結果表明，影響包合率的因素表現(xiàn)為包合比>包合溫度>包合時間，最終確定最佳試驗條件：包合反應溫度為61 ℃，包合反應比例為10 ∶1，包合反應時間為190 min，在此條件下包合率為72.75%，與軟件預測值（72.88%）接近（相對誤差0.178%）。

關鍵詞：羥丙基-β-環(huán)糊精;白屈菜紅堿;響應面分析法;包合作用;工藝優(yōu)化

中圖分類號： R284文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0135-05

收稿日期：2020-09-01

基金項目：西部地區(qū)創(chuàng)新能力建設項目（編號：發(fā)改辦高技[2016]2195號）;貴州省科技支撐計劃（編號：黔科合支撐[2019]2363號）;銅仁市科技計劃（編號：銅市科研[2019]113號、銅市科研[2019]109號）。

作者簡介：梁 浩（1987—），男，河北保定人，博士，副教授，主要從事藥用植物有效成分開發(fā)及應用研究。E-mail：249672111@qq.com。

白屈菜紅堿（chelerythrine）是從博落回、白屈菜、血水草以及飛龍掌血等藥用植物中提取得到的苯并菲啶型生物堿[1-3]。研究表明，白屈菜紅堿具有抗菌、抗炎、抗腫瘤和抗肝纖維化等多種藥理作用[4-5]，對農(nóng)作物病蟲害的防治也有較好的效果[6]。因此，白屈菜紅堿被廣泛應用于生物醫(yī)藥、獸藥和飼料添加劑以及生物農(nóng)藥中。尤其是在動物生產(chǎn)過程中，白屈菜紅堿具有促進動物生長、改善動物健康、預防動物疾病等多種功能[7]，由于白屈菜紅堿的分子結構特點，生物利用度較低，所以有必要通過制劑技術改進或提高白屈菜紅堿的溶解度和生物利用度[8]。

在提高難溶性藥物的水溶性和增加穩(wěn)定性方面，環(huán)糊精包合技術顯示出較大的優(yōu)勢[9]，而且藥物經(jīng)β-環(huán)糊精包合后可減輕口服后對胃腸道的刺激，提高療效，降低藥物毒性，并能保持藥物原有的性質(zhì)和作用[10]。在眾多的β-環(huán)糊精衍生物中，羥丙基-β-環(huán)糊精（ HP-β-CD）顯示出較強的應用價值，主要體現(xiàn)在水溶性更好，常溫下它在水中的溶解程度超過50%;人體中耐受性好，在體內(nèi)基本上不累積，也不被分解代謝;低毒、安全、無腎毒性、較好的藥物增溶性等。目前由于其優(yōu)良的性質(zhì)，在醫(yī)藥和食品等多個領域有著廣泛的應用[11]。

目前，關于環(huán)糊精及其衍生物對白屈菜紅堿的包合研究較少，本研究采用飽和水溶液法，以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料，對白屈菜紅堿進行包合，并通過響應面法優(yōu)化白屈菜紅堿包合物的制備工藝，采用紫外光譜法對白屈菜紅堿和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物和兩者的混合物以及羥丙基-β-環(huán)糊精的紫外光譜進行測定，并驗證白屈菜紅堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物是否形成。本研究旨在將白屈菜紅堿制備成 HP-β-CD包合物，以期改善其在水溶性和穩(wěn)定性方面的缺陷，從而為拓寬其適用范圍提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

白屈菜紅堿原料（高效液相色譜檢測純度為94.3%），參照文獻[12]自制;羥丙基-β-環(huán)糊精（純度99%）、白屈菜紅堿標準品（純度≥98%），均購自上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸等試劑（分析純），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

超聲波清洗機（KQ-218），購自昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計（T10CS），購自北京普析通用儀器有限責任公司;超高效液相色譜儀（Agilent1290），購自安捷倫科技有限公司;十萬分之一分析天平（CPA225D），購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;千分之一分析天平（AE223），購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司;真空干燥箱（DZF6030A），購自上海一恒科學儀器有限公司;數(shù)顯恒溫集熱式磁力攪拌器（DF-101S），購自鞏義市予華儀器有限責任公司;鼓風干燥箱（DHG-9013A），購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白屈菜紅堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備 稱取一定量HP-β-CD，加入5 mL蒸餾水，水浴加熱攪拌至溶解，緩慢加入0.1 g白屈菜紅堿，避光攪拌，攪拌結束后將反應液在40 ℃進行真空干燥，粉碎后即得包合物粉末。

1.3.2 白屈菜紅堿標準曲線的繪制 準確稱取標準品11.74 mg，用1.0%鹽酸-甲醇溶液（體積比為50 ∶50）溶解于容量瓶（100 mL）中，并定容，配制得到白屈菜紅堿標準溶液母液。準確量取標準品母液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于容量瓶（25 mL）中，并定容。液相色譜條件：選擇檢測波長271 nm，C18色譜柱，采用乙腈-0.1%磷酸作為流動相，控制流速為0.5 mL/min;保持柱溫25 ℃，進樣量為2 μL。

1.3.3 樣品溶液的配制及含量測定 按單因素試驗方案和響應面設計方案制備白屈菜紅堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，準確稱取10 mg白屈菜紅堿包合物，采用1.0%鹽酸-甲醇溶液（體積比為50 ∶50）溶解，超聲1 min，置于容量瓶（25 mL）中，稀釋定容，搖勻，采用有機溶劑微孔濾膜（0.45 μm）過濾，得待測包合物樣品溶液。采用高效液相色譜法（檢測波長為271 nm）測定包合物中白屈菜紅堿含量。

1.3.4 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物制備單因素試驗

對影響白屈菜紅堿包合率的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比、包合溫度、包合時間等3個單因素進行試驗，進而確定各因素響應面試驗取值范圍。包合率=1-（濾液中白屈菜紅堿質(zhì)量+包合物中未反應的白屈菜紅堿質(zhì)量）/稱量白屈菜紅堿質(zhì)量×100%。

1.3.4.1 包合比對白屈菜紅堿包合率的影響 在包合溫度為60 ℃，包合時間為1 h的條件下，研究不同包合比（1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1）對白屈菜紅堿包合率的影響，篩選最佳包合比。

1.3.4.2 包合溫度對白屈菜紅堿包合率的影響 在包合時間為1 h，包合比為6 ∶1的條件下，選取30、40、50、60、70、80 ℃ 6個包合溫度，篩選不同溫度下HP-β-CD 對白屈菜紅堿的包合效果，得到最佳包合溫度。

1.3.4.3 包合時間對白屈菜紅堿包合率的影響 在包合比為6 ∶1，包合溫度為60 ℃的條件下，篩選1、2、3、4、5、6 h反應時間下 HP-β-CD對白屈菜紅堿的包合效果，篩選最佳包合時間。

1.3.5 響應面試驗設計 結合單因素試驗結果，選取對反應結果影響較大的3個因素，包合比（X1）、包合溫度（X2）和包合時間（X3）進行試驗，采用3因素3水平的響應面法（RSM） 設計，采用多元回歸設計方法，以白屈菜紅堿包合率（Y）為響應值，通過優(yōu)化Box-Behnken響應面分析確定最佳的白屈菜紅堿包合參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

單因素試驗均重復3次，取平均值，試驗數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.1 軟件進行統(tǒng)計與分析，響應面試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 白屈菜紅堿標準曲線及回歸方程

以白屈菜紅堿標準品含量（x）為橫坐標，以峰面積（y）為豎坐標，所繪制的白屈菜紅堿的標準曲線見圖1，回歸方程為y=0.741 59+17.113 87x，r2=0.999 95，在 0～46.96 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 HP-β-CD與白屈菜紅堿的配比對包合率的影響

由圖2可知，白屈菜紅堿包合率隨著包合比的增大而增大，當包合比達到10 ∶1時包合率達到44.1%，當包合比繼續(xù)增大，白屈菜紅堿包合率開始減小，因此選擇10 ∶1為較佳條件。

2.2.2 包合溫度對包合率的影響

由圖3可知，白屈菜紅堿包合率隨包合溫度的升高不斷增大，當達到60 ℃時，白屈菜紅堿包合率達到44.1%，之后隨包合溫度的升高，包合率開始下降，可能是60 ℃時包合過程已到達平衡，溫度降低不利于白屈菜紅堿進入羥丙基-β-環(huán)糊精當中，溫度升高由于分子運動加劇，導致形成的包合物脫包合，因此選擇 60 ℃ 為較佳包合溫度。

2.2.3 包合時間對白屈菜紅堿包合率的影響

由圖4可知，白屈菜紅堿包合率隨著包合時間的延長而增大，攪拌3 h時包合率達到71.6%，之后隨包合時間的延長包合率下降，可能由于包合時間較短時白屈菜紅堿尚未完全進入羥丙基-β-環(huán)糊精當中，時間太長又會導致已形成的包合物脫包合。因此選擇包合時間3 h為較佳條件。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 數(shù)學模型方程

選取對包合反應影響較大的3個因素[包合比（X1）、包合溫度（X2）和包合時間（X3）]進行分析，包合試驗設計因素及水平見表1。響應面試驗結果見表2。將表2中的試驗數(shù)據(jù)采用 Design-Expert 8.0.6.1軟件進行分析，以白屈菜紅堿包合率（Y）為固定量，以包合比（X1）、包合溫度（X2）和包合時間（X3）為因變量，建立數(shù)學模型

方程為Y=71.46+8.14X1+1.95X2+0.31X3-2.66X1X2-0.17X1X3+0.39X2X3-12.76X21-4.35X22-0.45X23。對此模型方程進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，通過對模型方程顯著性檢驗，該模型P<0.000 1，達到極顯著水平（P<0.01），說明該模型高度顯著，失擬項（P=0.412 0>0.05）不顯著，

說明方程與試驗擬合度較好，可用于羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合反應的分析與預測。模型方差分析結果表明，各影響因素對白屈菜紅堿包合率影響大小的順序為包合比>包合溫度>包合時間。

2.3.2 包合工藝的響應面分析與優(yōu)化

圖5 為羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合工藝的響應面分析圖。圖5-a顯示包合時間為3 h時，羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比與包合溫度對包合率的影響，包合初始，包合率隨包合溫度的增大而增大，當包合溫度達到一定值后，白屈菜紅堿包合率又略有下降。

圖5-b顯示包合溫度為60 ℃時，羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比與包合時間對包合率的影響，當包合時間較短時，白屈菜紅堿包合率隨包合比的增大而增大，但隨包合時間的延長，包合率先增大后減少。

圖5-c顯示當羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比為10 ∶1時，包合反應溫度和包合反應時間對包合率的影響，在不同包合反應溫度下，包合率隨包合時間的延長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在不同包合時間下，白屈菜紅堿包合率隨包合溫度的升高也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在等高線圖橢圓中心和響應面3D圖的最高點處存在極大值。

2.3.3 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物包合最優(yōu)工藝條件確定

通過對響應面試驗結果分析得到的理論最佳工藝條件：包合比為10.30 ∶1，包合溫度為60.74 ℃，包合時間為3.17 h。在此條件下，羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合率理論最大值為72.88%。但考慮到實際操作性，將包合參數(shù)進一步修訂，最終確定羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的配比為10 ∶1，包合溫度為61 ℃，包合時間為 190 min，將此條件重復3次取平均值，得到包合率為72.75%，與預測值相對誤差為0.178%。證明擬合模型比較可靠，說明采用響應面分析的 Box-Behnken 組合設計優(yōu)化得到的白屈菜紅堿包合工藝參數(shù)準確可靠，具有一定的應用價值。

2.4 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物形成的驗證分析

通過對4種相同濃度的不同溶液（包括羥丙基-β-環(huán)糊精甲醇溶液、白屈菜紅堿甲醇溶液、白屈菜紅堿與羥丙基-β-環(huán)糊精混合物的甲醇溶液以及羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合物的甲醇溶液）進行紫外掃描后，其紫外光譜如圖6所示。由于不同物質(zhì)的紫外吸收光譜與物質(zhì)的結構有特定的對應關系，因此不同物質(zhì)的紫外吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異。由圖6可知，白屈菜紅堿和白屈菜紅堿-羥丙基-β-環(huán)糊精混合物（混合物）的波峰分別位于318、266.5 nm，羥丙基-β-環(huán)糊精-白屈菜紅堿包合物（包合物）的紫外光譜吸收曲線波峰位于314、266 nm，因此可判定得到的物質(zhì)并不是白屈菜紅堿與羥丙基-β-環(huán)糊精兩者的物理混合物，而是包合物。

3 結論

近年來環(huán)糊精包合技術的研究和應用越來越多，主要原因是其在提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性以及降低藥物毒性方面有很好的效果，從而拓寬藥物的適用范圍[13]，由于羥丙基-β-環(huán)糊精比母體 β-環(huán)糊精的水溶性更好、且毒性更低，所以選擇羥丙基-β-環(huán)糊精對白屈菜紅堿進行包合。

本試驗研究了羥丙基-β-環(huán)糊精對白屈菜紅堿的包合作用，在單因素試驗基礎上，利用 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化了白屈菜紅堿的包合工藝，最后確定最佳工藝條件：包合比為10 ∶1，包合溫度為61 ℃，包合時間為190 min，在此條件下白屈菜紅堿包合率達到72.75%。通過對因素的交互作用進行分析，對白屈菜紅堿包合率影響的大小順序為包合比>包合溫度>包合時間。經(jīng)紫外光譜驗證，包合物已經(jīng)形成。本試驗得到的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合物的制備工藝穩(wěn)定、可靠，為白屈菜紅堿新制劑的研究開發(fā)以及拓寬白屈菜紅堿的應用領域提供了理論依據(jù)。

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