李俊 牛志強 侯博 華利忠 韋艷娜 劉蓓蓓 王麗 謝星 張珍珍 熊祺琰 邵國青 李新國 馮志新

摘要：2018年自福建省疑似雞滑液囊支原體感染病雞中分離得到9株雞滑液囊支原體，采用微量肉湯稀釋法測定了其對9種抗菌藥物的敏感性，對篩選出的多重耐藥株（MS HB）進行了全基因組序列分析。結(jié)果顯示，福建地區(qū)雞滑液囊支原體臨床株對泰萬菌素和泰妙菌素較為敏感，對泰樂菌素、多西環(huán)素、土霉素和替米考星敏感性次之，而對氟苯尼考和恩諾沙星最不敏感。多重耐藥株（MS HB）基因組大小為766 081 bp;GC含量為28.02%;共注釋到1 464個基因，其中，包括多個毒力基因和1個耐藥基因（ermQ），與敏感標準株WVU1853全基因組序列比對得出大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物耐藥基因的多個突變位點。研究結(jié)果豐富了對雞滑液囊支原體流行病學(xué)的認識，并可為該地區(qū)臨床治療雞滑液囊支原體感染的合理用藥選擇提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：雞滑液囊支原體;藥物敏感性;全基因組測序分析

中圖分類號： S859.7文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0117-07

收稿日期：2020-10-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31800161、31900159）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20190261、BK20180297）。

作者簡介：李 ?。?987—），女，安徽馬鞍山人，博士，助理研究員，主要從事動物支原體耐藥機制研究。E-mail：lijunjaas@126.com。

通信作者：李新國，碩士，獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)藥理研究及臨床技術(shù)服務(wù)工作，E-mail：57740190@qq.com;馮志新，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病研究，E-mail：fzxjaas@163.com。

雞滑液囊支原體是一種無細胞壁的病原微生物，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，可引起雞和火雞的關(guān)節(jié)滑膜炎、呼吸系統(tǒng)疾病，蛋雞產(chǎn)蛋量下降、孵化率降低，肉雞飼料轉(zhuǎn)化率降低、胴體廢棄率升高等不同嚴重程度的亞臨床至臨床癥狀，也可能與其他病原（如傳染性支氣管炎、新城疫病毒、流感病毒、大腸桿菌和其他支原體等）合并繼發(fā)感染，或因飼養(yǎng)管理不善而加重病情[1]。

臨床防控雞滑液囊支原體感染主要依靠疫苗免疫和藥物治療。疫苗免疫主要用于長期防控，而藥物治療是最快速有效降低經(jīng)濟損失的途徑。大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和四環(huán)素類是臨床治療畜禽支原體感染最常用的藥物類別，但是在抗菌藥物長期大量使用的選擇性壓力下，耐藥菌株相關(guān)報道屢見不鮮[2]，造成臨床治療效果下降。本研究采用微量肉湯稀釋法測定了福建地區(qū)分離的雞滑液囊支原體對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物的敏感性，得到其流行病學(xué)特征，并對多重耐藥株的全基因組序列進行分析，以期為臨床謹慎合理選擇與使用抗菌藥物、遏制耐藥性產(chǎn)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病料的采集

2018年3—5月對福建省不同地區(qū)疑似雞滑液囊支原體感染病雞采集氣管拭子，置于KM2液體培養(yǎng)基中4 ℃保存，送往實驗室進行雞滑液囊支原體的分離培養(yǎng)與鑒定。參考菌株雞滑液囊支原體WVU 1853株受贈于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所張小飛研究員。

1.1.2 培養(yǎng)基

KM2液體與固體培養(yǎng)基，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病防控研究室提供。

1.1.3 抗菌藥物

牧樂興，中牧南京動物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（2 500萬U，批號：190227001）;酒石酸泰萬菌素，內(nèi)蒙古中牧生物藥業(yè)有限公司（882 U/mg，批號：AY 201807028）;酒石酸泰樂菌素，山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司（939 U/mg，批號：T-1709143）;延胡索酸泰妙菌素，山東勝利生物工程有限公司（80%，批號：TMP801903101）;替米考星，山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司（93.6%，批號：TMCZ1905044）;鹽酸多西環(huán)素，揚州聯(lián)博藥業(yè)有限公司（90.4%，批號：YD 190401108）;鹽酸土霉素，揚州聯(lián)博藥業(yè)有限公司（90.6%，批號：YT 190402054）;氟苯尼考，山東國邦藥業(yè)股份有限公司（100%，批號：701-1904090）;恩諾沙星，浙江國邦藥業(yè)有限公司（99.9%，批號：190917-5）。

1.2 方法

1.2.1 雞滑液囊支原體的分離

病料拭子在KM2液體培養(yǎng)基中經(jīng)劇烈振蕩，取上清懸液經(jīng)0.45 μm的濾器過濾，置于無菌的密閉培養(yǎng)管，37 ℃培養(yǎng) 18～20 h后，以1 ∶10轉(zhuǎn)移接種至新鮮KM2液體培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)14 d，逐日觀察培養(yǎng)基顏色變化，待顏色由玫瑰紅變?yōu)殚偌t色或黃色時，再次以1 ∶10接種新鮮培養(yǎng)基進行傳代。待臨床分離株穩(wěn)定傳至3～4代，倍比稀釋后采用KM2固體培養(yǎng)基進行克隆純化2次，在體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 雞滑液囊支原體的PCR鑒定

自KM2固體培養(yǎng)基挑取單個疑似菌落至2 mL的KM2液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)成熟后，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取疑似雞滑液囊支原體菌株的DNA作為模板進行PCR及序列測定。采用OIE推薦的雞滑液囊支原體檢測引物（MS-F：5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′，MS-R：5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′），預(yù)期擴增片段為185 bp。具體PCR擴增條件參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《禽支原體PCR檢測方法NY/T 553—2015》。

1.2.3 抗菌藥物對雞滑液囊支原體的最小抑菌濃度測定

參考Hannan推薦的微量稀釋法測定抗菌藥物對雞滑液囊支原體臨床分離株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[3]。稱取待試藥物，無菌操作溶解于相應(yīng)稀釋液，配制母液濃度為1 280 μg/mL，將各藥物母液用KM2液體培養(yǎng)基按照2倍稀釋法稀釋成10個工作液濃度。根據(jù)不同分離株的顏色變化單位（CCU）調(diào)整菌液接種量至104～105 CCU/mL。在96孔細胞微孔板中進行MIC測定。設(shè)置WVU 1853為質(zhì)控菌株，KM2液體培養(yǎng)基為陰性對照，菌株培養(yǎng)液為陽性對照，同時各MIC試驗設(shè)置3個平行。將96孔細胞微孔板密封后至于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，逐日觀察顏色變化，記錄初始MIC值與終末MIC值。判定標準為陰性對照孔不變色，陽性對照孔變?yōu)辄S色，以試驗孔不發(fā)生肉眼可見顏色變化的最低藥物濃度孔為該藥物對該菌株的MIC。

1.2.4 雞滑液囊支原體耐藥株全基因組序列分析

對于呈現(xiàn)多重耐藥表型的雞滑液囊支原體MS HB株，提取其全基因組DNA采用Illumina PE150平臺進行測序，具體工作交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。簡要測序步驟如下：應(yīng)用Illumina Nova Seq PE150技術(shù)對構(gòu)建的PE文庫（～350 bp）文庫測序。對于原始下機數(shù)據(jù)使用readf（Version 10）進行過濾，得到有效數(shù)據(jù)，采用SOAP denovo（Version 2.04）、SPAdes、ABySS軟件進行基因組組裝，并最終使用CISA軟件進行整合，采用gapclose（Version1.12）對初步組裝結(jié)果進行優(yōu)化和補洞。

使用GeneMarkS（Version 4.17）軟件對新測序的基因組進行編碼基因預(yù)測，對預(yù)測基因進行COG功能分類、GO注釋、KEGG通路分析。利用tRNAscan-SE、rRNAmmer和Rfam database軟件對tRNA、rRNA和sRNA進行預(yù)測，IslandPath-DIOMB（Version 0.2）軟件對基因島進行預(yù)測，phiSpy軟件（Version 2.3）對前噬菌體進行預(yù)測，CRISPRdigger（Version 1.0）對CRISPR進行預(yù)測。使用TCDB（Transporter Classification Database）數(shù)據(jù)庫分析轉(zhuǎn)運蛋白，VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）數(shù)據(jù)庫分析毒力基因，ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database）數(shù)據(jù)庫分析耐藥基因，對比對得到的靶點突變設(shè)計引物進行PCR，結(jié)合桑格爾測序驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞滑液囊支原體的分離鑒定結(jié)果

經(jīng)實驗室分離純化培養(yǎng)、分子生物學(xué)鑒定程序，自福建地區(qū)病雞氣管拭子樣品中成功分離得到9株雞滑液囊支原體，由圖1-A可知，其KM2液體培養(yǎng)物呈紫紅色，輕微振蕩，有絲狀或絮狀物懸浮。雞滑液囊支原體在KM2固體培養(yǎng)基上生長7～14 d，肉眼觀察可見無色、透明、細小、圓形菌落。由圖1-B可知，體視顯微鏡下低倍（40×）觀察可見典型“油煎蛋”狀特征，光滑扁平、邊緣整齊、菌落中央致密隆起。

對于平板克隆后的雞滑液囊支原體疑似菌株，試劑盒法提取其DNA，采用OIE推薦的雞滑液囊支原體檢測引物進行PCR擴增鑒定。由圖2可知，測試菌株均成功擴增出特異性條帶，長度為185 bp，與陽性對照WVU1853株一致，表明疑似菌株均可判定為雞滑液囊支原體。

2.2 MIC測定結(jié)果

雞滑液囊支原體臨床分離株（9株）與標準株（1株）對牧樂興等9種常用抗菌藥物的敏感性測定結(jié)果見表1。由表1可知，牧樂興與泰萬菌素對所

有MS菌株的MIC測定結(jié)果較為一致。多數(shù)雞滑液囊支原體臨床株對泰萬菌素、泰妙菌素較為敏感，對泰樂菌素、多西環(huán)素、土霉素和替米考星敏感性次之，對氟苯尼考和恩諾沙星最不敏感。其中，多種抗菌藥物對MS HB株的MIC值均較高，提示MS HB株可能為多重耐藥支原體。

2.3 MS HB株全基因組序列分析結(jié)果

將多重耐藥MS HB株通過Illumina PE150平臺進行全基因組測序，經(jīng)序列組裝和整合優(yōu)化分析，其基因組基本信息見表2。由表2可知，HB株基因組總長度為766 081 bp，GC含量28.02%，N50長度為 83 641 bp，N90長度為14 900 bp，最長片段為 115 534 bp，最短片段為512 bp。由圖3可知，注釋后總共有1 464個編碼基因，基因總長度為 516 525 bp，占基因組全長的67.42%，平均長度為353 bp?；蚪M含有34個tRNA編碼基因， 3個5SrRNA，1個16SrRNA和1個23SrRNA。由圖4可知，基因島是與病原機理、生物體的適應(yīng)性等多種生物功能相關(guān)的基因組區(qū)段，共預(yù)測到2個基因島。

由圖5可知，對預(yù)測基因進行COG功能分類，共有235個基因被分為18種COG分類;由圖6可知，共有2 875個基因注釋上42條GO功能分類，樣本基因的功能在生理過程分類中主要聚集于細胞進程（413個）和代謝過程（405個）;在分子功能主要聚集于結(jié)合（341個）和催化活性（373個）。由圖7可知，對基因進行KEGG注釋，561個基因共注釋上90個通路，最多見的4個注釋通路分別是代謝通路（89個）、核糖體（43個）、次級代謝產(chǎn)物生物合成（27個）和多樣環(huán)境中的微生物代謝（27個）。

通過與細菌致病毒力因子數(shù)據(jù)庫（VFDB）比對，MS HB株基因組共注釋到9個毒力相關(guān)基因，主要包括dnaK、cylA、EF-Tu、lplA1、SSU98、oppF、pdhB、vlh和GAPDH等，具體注釋見表3。

通過ARDB數(shù)據(jù)庫注釋，MS HB株基因組中注釋到1個耐藥基因ermQ，該耐藥基因的基因序列編號為：GM000161。將MS HB株的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因：23S rRNA基因（rrlA和rrlB）、L4核糖體蛋白編碼基因（rplD）、L22核糖體蛋白編碼基因（rplV）以及氟喹諾酮類藥物靶點：DNA旋轉(zhuǎn)酶編碼基因（gyrA和gyrB）和拓撲異構(gòu)酶IV編碼基因（parC和parE）與GenBank中已公布全基因組序列的MS WVU1853株（登錄號：NZ CP011096）進行比對，獲得其基因突變位點與相應(yīng)氨基酸突變位點，由表4可知，這些基因突變可能導(dǎo)致藥物作用靶位改變，與抗生素親和力下降，從而引起耐藥。

3 討論

支原體缺乏細胞壁結(jié)構(gòu)，作用于細胞壁的β-內(nèi)酰胺類藥物對其無效，而作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制環(huán)節(jié)的大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物抗支原體效果較強[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，福建地區(qū)分離的雞滑液囊支原體臨床株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物（泰萬菌素、泰樂菌素和替米考星）、截短側(cè)耳素類（泰妙菌素）和四環(huán)素類（多西環(huán)素和土霉素）較為敏感，而抗菌藥物氟苯尼考和恩諾沙星由于在獸醫(yī)臨床的廣泛應(yīng)用，雞滑液囊支原體臨床株對其敏感性降低，與國內(nèi)相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)較為一致。

丁美娟等2012—2014年測定自河南、江蘇、安徽、河北和廣東5省分離得到的雞滑液囊支原體代表株藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)其對泰樂菌素較為敏感，對氟喹諾酮類藥物具有不同程度的抗藥性[6]。2015—2017年招麗嬋等分析了廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等地10個不同地區(qū)雞滑液囊支原體代表株，發(fā)現(xiàn)其均對泰妙菌素、泰萬菌素、泰樂菌素和多西環(huán)素較為敏感，而對金霉素、慶大霉素等敏感性下降，甚至出現(xiàn)不同程度耐受性，對鹽酸環(huán)丙沙星、沙拉沙星敏感性較低[7]。石曉磊等2017年初從寧夏地區(qū)采集87份疑似感染雞病料，分離得到13株雞滑液囊支原體，每個分離地隨機挑選1株進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)3株滑液囊支原體均對泰萬菌素、泰妙菌素、泰樂菌素敏感，而對氟苯尼考和恩諾沙星有一定的耐受性[8]。Kreizinger等2002—2016年自歐洲中部和東部7個國家采集到41株雞滑液囊支原體， 發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類（多西環(huán)素、土霉素和金霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（泰萬菌素、泰樂菌素和替米考星）、截短側(cè)耳素類（泰妙菌素和沃尼妙林）以及鹽酸林可大觀對其具有體外抑菌效果，而氟喹諾酮類（恩諾沙星、雙氟沙星），新霉素，壯觀霉素，林可霉素和氟苯尼考的MIC值較高[9]。

本研究應(yīng)用Illumina Nova Seq PE150技術(shù)對多重耐藥株（MS HB）進行全基因組序列分析，破解其耐藥與毒力相關(guān)因子遺傳信息。通過與VFDB數(shù)據(jù)庫比對，挖掘到MS HB基因組中存在多個毒力相關(guān)因子，包括dnaK、cylA、EF-Tu、lplA1、SSU98、oppF、pdhB、 vlh和GAPDH等。與其他支原體相同， 如牛支原體[10]、雞毒支原體[11]、豬肺炎支原體[12-13]等，這些毒力相關(guān)因子可參與支原體感染宿主細胞、逃避免疫并引起宿主免疫病理反應(yīng)，在支原體動物體內(nèi)定殖和存活中起著重要作用[14]。

通過與ARDB數(shù)據(jù)庫進行比對，分析得到MS HB株基因組中存在大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermQ，該基因最早在產(chǎn)期莢膜梭菌中發(fā)現(xiàn)，可介導(dǎo)對大環(huán)內(nèi)酯類-林可霉素-鏈陽菌素B（MLS）耐藥[15]。

ermQ基因作用機制主要為編碼甲基化酶，使核糖體23S rRNA基因甲基化，導(dǎo)致MLS失去對雞滑液囊支原體的抑制作用。本研究首次報道在雞滑液囊支原體基因組中檢測到ermQ抗性基因。支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物最重要的耐藥機制是核糖體上23S rRNA結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)和Ⅴ區(qū)靶點突變[16]。雞滑液囊支原體基因組中包含2個rrn操縱子，每個操縱子具有1個23S rRNA基因。研究報道23S rRNA基因Ⅱ區(qū)突變位點較少，目前僅有G748A報道[17]，與其他支原體類似。Inna Lysnyansky和Katinka Beko等發(fā)現(xiàn)，雞滑液囊支原體23S rRNA基因Ⅳ區(qū)最常見的靶點突變?yōu)镚2057A、A2058G和A2059G[4，17]。本研究中雞滑液囊支原體臨床株（MS HB株）對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（泰萬菌素、泰樂菌素和替米考星）呈現(xiàn)高度耐藥特征，但通過比對并未在這些常見位點檢測到突變，推測其對大環(huán)內(nèi)酯類主要耐藥機制可能由ermQ所介導(dǎo)。恩諾沙星對MS HB株的MIC值與敏感標準株WVU1853相比，升高32倍。比較兩者氟喹諾酮類靶酶編碼基因（gyrA、gyrB、parC和parE），發(fā)現(xiàn)多個突變位點，可能與其耐藥性相關(guān)，但需要進一步驗證，其中ParC蛋白的T85I位點突變在近期文獻[4]中亦有報道。

目前，抗菌藥物治療仍是國內(nèi)臨床防控雞滑液囊支原體感染最有效的方法。根據(jù)本研究結(jié)果，防治雞滑液囊支原體感染，可首選泰萬菌素和泰妙菌素;而針對雞滑液囊支原體與其他細菌性疾病的混合感染，可考慮與多西環(huán)素、氟苯尼考等抗菌藥物聯(lián)合用藥進行防控。支原體雖然生長緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，但其臨床分離鑒定與長期耐藥性檢測具有重要臨床意義，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗審慎合理選擇敏感藥物進行治療。未來也可針對其耐藥機制建立耐藥突變位點的分子生物學(xué)快速檢測方法，達到預(yù)測耐藥性的目的，可縮短支原體培養(yǎng)與藥敏實驗時間，亦可為臨床治療雞滑液囊支原體感染的合理用藥選擇提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

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