鄭貴星，陳冰霞，張夢欣，金晨曦，謝世豪，齊艷偉

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 輸血科，廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學 第三臨床學院，廣州 511436；3.廣州醫(yī)科大學 病原生物學與免疫學教研室，廣州 511436)

瘧疾是由瘧原蟲引起的傳染性蟲媒病，其發(fā)生發(fā)展由宿主和寄生蟲的相互作用引起，包括微血管中紅內期寄生蟲受到的物理阻隔和寄生蟲在宿主體內生長、傳播過程中釋放的有毒產(chǎn)物誘發(fā)的局部和全身炎癥[1]。另外，機體也會作出一定的反應進行自我防御，這種保護是通過細胞和體液免疫效應機制介導的，尤其是體液免疫，其對疾病血液階段的發(fā)展至關重要[2]。例如，B細胞產(chǎn)生的抗瘧疾特異性抗體在限制血液階段寄生蟲繁殖和延緩疾病進展及阻止寄生蟲全面感染中發(fā)揮關鍵作用[3]。

小鼠外周血B細胞、T細胞和NK細胞等免疫細胞百分比可反映機體免疫應答水平。其中，NK細胞主要存在于外周血中，其發(fā)揮殺傷作用不受外周血抗體等影響[4]。相關研究顯示，NK細胞參與宿主抗瘧原蟲感染[5]，且在伯氏瘧原蟲(Plasmo-diumberghei)血液感染時期含量下降[6]。

作為趨化因子成員之一的CXCR3，有CXCR3-A、CXCR3-B、CXCR3-alt 3種亞型，可在B細胞、T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、單核細胞等免疫細胞中表達[7]。CXCR3配體可通過參與激活MAPK、AKT等多種信號通路發(fā)揮免疫功能[8]；此外，其可與多種配體結合參與免疫細胞的遷移和功能發(fā)揮[9]。CD69是細胞表面的一種二聚體蛋白，可在B細胞、T細胞等免疫細胞中表達[10]。CD69在激活后的免疫細胞表面迅速被表達以增加機體IL-2R水平、促進Th1型細胞因子分泌等參與免疫細胞的增殖活化等過程[11]。CD62L是選擇素家族成員之一，主要在淋巴細胞、單核細胞等免疫細胞中表達[12]，其可參與調節(jié)免疫細胞浸潤免疫器官、腫瘤局部、炎癥部位等協(xié)助機體發(fā)揮免疫保護作用[13]。

WHO《2018年世界瘧疾報告》顯示，2017年全球共有瘧疾病例2.19億例，死亡人數(shù)也高達43.5萬人。而我國2018年的瘧疾數(shù)據(jù)表明已無本地感染病例出現(xiàn)，99.0%的瘧疾病例來源于境外輸入[14]。這些數(shù)據(jù)也說明全球的瘧疾形勢仍不容樂觀。同時，目前東南亞使用的抗惡性瘧原蟲感染的一線藥物青蒿素已出現(xiàn)了一定的抗藥性[15]，這更為人類全面消除瘧疾帶來嚴峻考驗。因此，現(xiàn)許多學者致力于瘧疾疫苗的研究。目前，針對瘧原蟲的發(fā)育周期，相關疫苗主要分為三大類，分別是肝期瘧疾疫苗、血液階段瘧疾疫苗以及蚊媒期的傳播阻斷疫苗[16]。雖然仍未有瘧疾疫苗投入臨床使用，但這也是防治瘧疾的一大有效途徑。另外，還可以通過控制病媒預防瘧疾，主要措施有使用殺蟲劑處理過的蚊帳和室內殘留噴霧劑噴灑[17]。為此，本研究檢測小鼠B細胞、T細胞、CD8+T細胞和NK細胞百分比及其表面分子CXCR3、CD69、CD62L的表達水平變化，探索C57BL/6小鼠外周血循環(huán)中不同的免疫細胞及其表面分子在伯氏瘧原蟲感染后的功能狀態(tài)，以此為學界探究瘧原蟲的致病機制和研發(fā)血液階段疫苗提供新的證據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠，10只，雌性，20～25 g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心；伯氏瘧原蟲ANKA株，由廈門大學李劍博士惠贈，于廣州霍夫曼免疫研究所長期保存。

1.2 試劑與儀器Hank＇s液、PBS和紅細胞裂解液，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RPMI 1640基礎培養(yǎng)液和FBS，購自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠抗CD19-PerCP-Cy5.5、抗CD3-FITC和抗NK1.1-PE-Cy7流式抗體，購自BioLegend公司；小鼠抗CD8-APC-Cy7、抗CD69-Pacific Blue、抗CD62L-APC和抗CXCR3-PE流式抗體，購自Abcam公司。FACSCalibur流式細胞儀，來自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 模型鼠的培養(yǎng) 于標準SPF環(huán)境中(溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%)飼養(yǎng)模型鼠，自由飲食飲水。將10只C57BL/6小鼠隨機均分為感染組和對照組(n=5)；予感染組小鼠尾靜脈注射106個伯氏瘧原蟲(用100 μL生理鹽水稀釋)，予對照組小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。實驗操作過程符合廣州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會要求。

1.3.2 樣本的采集 于感染第6天(Day 6, D6)自小鼠眼眶后靜脈叢取血1.5 mL，置于離心管中，加入200 μL抗凝劑，充分搖勻，置冰上備用。

1.3.3 小鼠外周血免疫細胞懸液的制備 將采集的外周血與1 mL Hank＇s液混合，將所得的細胞懸液轉移至離心管，600×g離心5 min后棄上清液并重懸。用Hank＇s液漂洗2次后，每500 μL加入5 mL常溫紅細胞裂解液裂解紅細胞，于室溫條件下靜置5 min。分別加入5 mL Hank＇s液終止裂紅，600×g離心5 min，棄上清液。加入5 mL Hank＇s液重懸后，600×g離心5 min，棄上清液。將細胞沉淀轉移至RPMI 1640培養(yǎng)液中，用1 mL 5% FBS重懸，通過血細胞計數(shù)板計算免疫細胞密度。

1.3.4 小鼠外周血免疫細胞亞群和細胞因子水平的檢測 調整細胞密度至每孔100 μL混懸液中含1.5×106個細胞，用200 μL PBS漂洗后600×g離心5 min并棄上清液，用100 μL/孔PBS重懸。按照試劑盒說明書將適量流式抗體加至細胞懸液中，進行15 s的渦旋振蕩(混合抗體和細胞)。于4 ℃避光條件下孵育30 min，加入2 mL PBS終止染色并離心(600×g，5 min)，棄上清液后漂洗細胞1次；用250 μL上機液重懸細胞。FACS檢測染色細胞，通過CytExpert軟件分析并得出檢測結果。

2 結果

2.1 兩組小鼠外周血B、T、CD8+T細胞和NK細胞百分比的比較分離兩組小鼠外周血并制備單細胞懸液，F(xiàn)ACS檢測B細胞(CD3-CD19+)、T細胞(CD3+CD19-)、CD8+T細胞(CD3+CD8+)和NK細胞(CD19-CD3-NK1.1+)百分比。結果顯示，感染組小鼠外周血B細胞水平顯著低于對照組[(7.28±0.57)%vs(44.49±4.31)%，P<0.01，圖1A、1D]；感染組小鼠T細胞、CD8+T細胞和NK細胞百分比與對照組相比差異不顯著[(33.26±6.65)%vs(35.99±3.45)%，(17.86±5.34)%vs(14.61±3.86)%，(13.32±1.92)%vs(11.75±1.64)%，均P>0.05，圖1]。

注： A. 兩組小鼠外周血B細胞和T細胞百分比FACS結果；B. 兩組小鼠外周血CD8+T細胞百分比FACS結果；C. 兩組小鼠外周血NK細胞百分比FACS結果；D. 兩組小鼠外周血免疫細胞百分比統(tǒng)計結果。**P<0.01。

2.2 兩組小鼠外周血免疫細胞表面CXCR3表達水平的比較FACS結果顯示，感染組小鼠外周血B細胞、T細胞表面CXCR3表達水平顯著高于對照組[(10.52±0.65)%vs(5.46±1.59)%，(25.44±5.67)%vs(12.45±0.23)%，均P<0.05，圖2A、2C]；感染組NK細胞表面CXCR3表達水平顯著低于對照組[(2.33±0.23)%vs(5.42±1.37)%，P<0.05，圖2B、2C]；感染組CD8+T細胞表面CXCR3表達水平比對照組高，但差異無統(tǒng)計學意義[(30.13±6.40)%vs(21.29±0.60)%，P>0.05，圖2A、2C]。

注：A. 兩組小鼠外周血B細胞、T細胞和CD8+T細胞表面CXCR3表達水平比較；B. 兩組小鼠外周血NK細胞表面CXCR3表達水平比較；C. 兩組小鼠外周血免疫細胞表面CXCR3表達水平統(tǒng)計結果。*P<0.05。

2.3 兩組小鼠外周血免疫細胞表面CD69表達水平的比較FACS結果顯示，感染組小鼠外周血T細胞、CD8+T細胞和NK細胞表面CD69表達水平顯著高于對照組[(25.89±1.89)%vs(1.68±0.56)%，(20.43±3.91)%vs(2.34±1.05)%，(34.58±1.67)%vs(5.28±1.04)%，均P<0.001，圖3]；而感染組小鼠B細胞表面CD69表達水平高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義[(38.83±2.24)%vs(15.29±15.12)%，P>0.05，圖3A、3C]。

注：A. 兩組小鼠外周血B細胞、T細胞和CD8+T細胞表面CD69表達水平比較；B. 兩組小鼠外周血NK細胞表面CD69表達水平比較；C. 兩組小鼠外周血免疫細胞表面CD69表達水平統(tǒng)計結果。***P<0.001。

2.4 兩組小鼠外周血免疫細胞表面CD62L表達水平的比較FACS結果顯示，感染組小鼠外周血B、T細胞、CD8+T細胞和NK細胞表面CD62L表達水平顯著低于對照組[(32.62±5.73)%vs(92.31±0.49)%，(2.60±0.50)%vs(76.33±8.34)%，(1.80±0.51)%vs(88.07±2.63)%，(0.25±0.06)%vs(14.69±2.37)%，均P<0.001，圖4]。

注：A. 兩組小鼠外周血B細胞、T細胞和CD8+T細胞表面CD62L表達水平比較；B. 兩組小鼠外周血NK細胞表面CD62L表達水平比較；C. 兩組小鼠外周血免疫細胞表面CD62L表達水平統(tǒng)計結果。***P<0.001。

3 討論

有研究表明，在感染伯氏或約氏瘧原蟲后，小鼠脾臟T細胞百分比明顯下降[18-19]。本研究中，小鼠外周血T細胞百分比下降不顯著，筆者考慮可能是T細胞在不同組織中的免疫功能狀態(tài)存在差異所致。另外，CD4+T細胞與CD8+T細胞比值的合理是機體免疫功能穩(wěn)定的一個重要支點[20]。在同樣感染伯氏瘧原蟲的條件下，小鼠脾臟CD8+T細胞水平明顯下降，其表達的CD69水平上升而CD62L下降[18]。本研究中，外周血CD8+T細胞變化不明顯，可能與組織樣本不同有關，而外周血CD8+T細胞表達的CD69、CD62L變化趨勢與其相同，有關因素還需進一步研究。此外，CD4+T細胞和B細胞協(xié)同作用產(chǎn)生的抗體是機體抵抗瘧原蟲紅內期感染的關鍵免疫成分[21]。本研究中，小鼠感染伯氏瘧原蟲后外周血B細胞百分比顯著下降(P<0.01)，而其他細胞沒有明顯變化，考慮伯氏瘧原蟲感染后D6外周血B細胞可能增殖受抑而不能有效發(fā)揮抗感染免疫。

在伯氏瘧原蟲ANKA蟲株感染模型中，脾臟會一定程度上調T細胞表面分子CXCR3表達[6]。本研究中，小鼠感染伯氏瘧原蟲后外周血B細胞和T細胞的CXCR3分子表達水平顯著提高(均P<0.05)，而其在NK細胞中表達則顯著下降(P<0.05)，提示感染伯氏瘧原蟲后，機體可通過特異性提高免疫細胞CXCR3表達發(fā)揮一定的抗感染作用。

之前有研究證實，小鼠腸系膜淋巴結可提高NK細胞、NKT細胞等分泌CD69抵抗日本血吸蟲感染[22]。B細胞可在多種致病菌感染條件下表達CD69，如金黃色葡萄球菌感染[23]；且有研究表明，外周血免疫細胞CD69表達水平與新生兒早期感染有一定關系[24-25]。本研究表明，感染伯氏瘧原蟲后小鼠外周血T細胞、CD8+T細胞和NK細胞等CD69表達水平顯著提高(均P<0.001)，提示機體可能通過促進固有和適應性免疫細胞表面CD69的表達抵抗瘧原蟲感染。在蘭巧芬等[26]的研究結果中，類風濕關節(jié)炎患者體內CD62L表達水平提高，其促進了嗜堿性粒細胞向特定組織遷移從而參與致病。此外研究表明，CD62L可能對臨床應用中T細胞的篩選有積極幫助，或可拓寬CAR-T細胞的應用范圍并有利于抗腫瘤治療[26]。

由本研究可知，伯氏瘧原蟲感染后小鼠外周血B細胞、T細胞、CD8+T細胞和NK細胞表面CD62L表達水平顯著降低(均P<0.001)，提示寄生蟲感染后機體或通過下調免疫細胞CD62L表達一定程度上抑制免疫細胞的免疫功能和遷移過程。