李海亮，李浩浩，魏倩倩

(眉縣食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 眉縣 722301)

眉縣是我國(guó)獼猴桃主產(chǎn)區(qū)之一，也是“國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品”“國(guó)家生態(tài)原產(chǎn)地保護(hù)產(chǎn)品”縣。近年來(lái)，隨著栽植面積和市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品需求量的大幅增加，獼猴桃生產(chǎn)與銷售面臨產(chǎn)品質(zhì)量控制難，產(chǎn)品銷售市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈，產(chǎn)業(yè)鏈需全程科學(xué)、規(guī)范、高效管理等問(wèn)題[1]。

氯吡脲(Forchlorfenuron)是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、分化和增大，促進(jìn)花芽發(fā)育，防止落花落果，提高果實(shí)坐果率和促進(jìn)果實(shí)膨大等功效，是目前使用最廣泛的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一。近年來(lái)一些獼猴桃果實(shí)生理和品質(zhì)研究表明，氯吡脲對(duì)獼猴桃果品的口感和品質(zhì)有一定影響，引起了人們關(guān)注。目前氯吡脲檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要2個(gè)，一是GB/T 20770-2008《糧谷中486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法》，規(guī)定了檢測(cè)486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品的方法，為規(guī)避雜質(zhì)對(duì)多種檢測(cè)目標(biāo)物的干擾，前處理過(guò)程較為復(fù)雜；二是GB 23200.110-2018《植物源性食品中氯吡脲殘留量的測(cè)定 液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用法》，針對(duì)植物源性產(chǎn)品專門(mén)檢測(cè)氯吡脲，提取液要經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鎂和PSA凈化，前處理過(guò)程也較為復(fù)雜，對(duì)此有人對(duì)西瓜[4]、蔬菜[5-6]氯吡脲檢測(cè)的樣品凈化方法作了有益嘗試并取得較好效果。迄今獼猴桃果品氯吡脲檢測(cè)國(guó)內(nèi)尚無(wú)簡(jiǎn)便、可靠方法，為此我們進(jìn)行了檢測(cè)方法優(yōu)化，并采用新確立的方法對(duì)眉縣獼猴桃氯吡脲殘留量進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 氯吡脲測(cè)定方法的確定

1.1.1 儀器與試劑 主要有高效液相色譜儀串聯(lián)三級(jí)四重桿質(zhì)譜儀、高速冷凍離心機(jī)、超聲提取儀；氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品(濃度100 μg·ml-1，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所)、甲醇、乙腈、一級(jí)水、C18填料、PSA填料、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、0.22 μm有機(jī)濾膜。

標(biāo)樣溶液配制：稱取一定量的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成8 μg·ml-1的標(biāo)樣儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于0～4 ℃的條件下，根據(jù)需要用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度的標(biāo)樣溶液。

1.1.2 儀器參數(shù)

(1)色譜條件

色譜柱：C18 柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：甲醇；流動(dòng)相C：0.1%甲酸水；流動(dòng)相D：乙腈；流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。梯度程序如表1。

表1 流動(dòng)相梯度程序

(2)質(zhì)譜條件

正、負(fù)離子模式下氯吡脲均有較強(qiáng)響應(yīng)，15 ng·ml-1氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定條件下正離子響應(yīng)為1.04×106；負(fù)離子模式響應(yīng)為5.48×105。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，負(fù)離子模式下存在雜質(zhì)干擾，檢測(cè)值不穩(wěn)定且加標(biāo)回收率偏?。欢x子模式下回收率和精密度均符合要求，故選擇正離子模式。正離子模式條件為：碰撞氣為氮?dú)?；電噴霧電壓為3 200 V；離子傳輸管溫度320 ℃；離子源溫度350 ℃；輔助氣壓力5Arb；SRM模式下的參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 正離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)

1.1.3 樣品前處理 稱取均質(zhì)樣品5.0 g放入50 mL塑料離心管內(nèi)，加入10 mL乙腈(分析純)渦旋提取2 min，超聲5 min，以6 000 r/min離心5 min，取上清液到另一離心管中備用；再用10 mL乙腈試劑對(duì)原樣品殘?jiān)鼫u旋提取一次，離心取全部上清液與第一步的提取液合并，向合并后的提取液中加入2 g氯化鈉，渦旋混勻，離心后取適量上層提取液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2 獼猴桃果品氯吡脲含量測(cè)定

1.2.1 樣品采集 在全縣范圍內(nèi)選取栽植面積大而集中，管理技術(shù)水平具有代表性的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，再在所選鄉(xiāng)鎮(zhèn)選取有代表性的田塊，并在其中隨機(jī)選取生長(zhǎng)正常的植株5個(gè)并編號(hào)掛牌(樣株)，在每個(gè)樣株不同方位選取基本等量的果品。樣品采集時(shí)間為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后第80、90、100 d，每次采集時(shí)每個(gè)樣株選取的果品按株混合、及時(shí)預(yù)處理和妥善保存。

1.2.2 測(cè)定方法 按2.1 氯吡脲確定的測(cè)定方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取和凈化

2.1.1 溶劑乙腈量的選擇 采用提取率較高的乙腈提取法，在獼猴桃陰性樣品中添加一定量(20 μg·kg-1)氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液,10 ml乙腈一次提取、20 ml乙腈一次提取、20 ml乙腈二次提取，回收率分別為90.5%、93.7%和95.4%，表明使用20 ml乙腈分二次提取更充分。

2.1.2 除雜過(guò)程的選擇 經(jīng)對(duì)獼猴桃陰性樣品進(jìn)行50 μg·kg-1水平氯吡脲加標(biāo)(限量值加標(biāo))，收集二次10 ml乙腈提取液混勻，取3 ml加入到各實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的除雜試劑中(同時(shí)做不除雜對(duì)照)，渦旋離心后取上清液檢測(cè)，取得的不同除雜試劑回收率結(jié)果如表3。

從表3可看出，獼猴桃樣品經(jīng)過(guò)乙腈提取后，提取液中會(huì)含有來(lái)自于獼猴桃樣品中的水分，這部分水分會(huì)對(duì)提取液產(chǎn)生稀釋作用，從而導(dǎo)致加標(biāo)回收率偏低。而采用氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂或無(wú)水硫酸鈉除水后的提取液避免了水分對(duì)樣品的稀釋，從而實(shí)驗(yàn)回收率趨于正常。不除雜的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，上機(jī)檢測(cè)出峰位置并無(wú)雜質(zhì)干擾，只是回收率處于較低水平；單純使用氯化鈉除水后的樣品，檢測(cè)結(jié)果同樣無(wú)雜質(zhì)干擾，且回收率較為理想。與使用氯化鈉除水相比，使用無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水硫酸鈉除水時(shí)，使用前需要對(duì)試劑烘干，且成本高于氯化鈉，故本研究確定單獨(dú)使用氯化鈉分離樣品中水分的方法。在獼猴桃稱樣量5.0 g、20 ml乙腈提取的條件下，2 g氯化鈉即可在獼猴桃樣品所含的水分中達(dá)到飽和并析出，從而與乙腈分層，所以本方法最終確定了 “2.1.3樣品前處理”中的提取方法。

圖1 空白基質(zhì)中添加氯吡脲標(biāo)樣溶液的選擇粒子總流圖(20 μg·ml-1)

表3 不同除雜試劑的氯吡脲加標(biāo)回收率

2.2 線性方程及檢出限

通過(guò)配置不同濃度梯度的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品(0.08～30 ng·ml-1)檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，得到線性歸方程為：Y=0.218 6×106x+0.527×105，R2=0.999 6，線性良好。以3倍信噪比(S/N=3)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)樣溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為儀器的最低檢測(cè)濃度，再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)(20倍)，確定本法的最低檢出限為0.4 μg·kg-1。

2.3 測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精確度

在獼猴桃氯吡脲陰性樣品中添加濃度分別為0.4、10、100 μg·kg-1時(shí)，測(cè)定計(jì)算結(jié)果顯示，本方法回收率為85%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.26%～5.47%(表4)。試驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足GB/T27404-2008要求。該方法最低檢出限為0.4 μg·kg-1。

圖2 氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 獼猴桃氯吡脲測(cè)定方法的可行性

對(duì)比美國(guó)環(huán)境保護(hù)局對(duì)大部分水果規(guī)定的氯吡脲最大殘留量0.01 mg·kg-1，我國(guó)GB 2763-2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的獼猴桃(食品)氯吡脲最大殘留限量0.05 mg·kg-1，和本實(shí)驗(yàn)獼猴桃4個(gè)品種(徐香、紅陽(yáng)、海沃德、秦美)的陰性樣品不同濃度氯吡脲加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)及最低檢出限0.4 μg·kg-1，表明本方法能滿足獼猴桃果品氯吡脲殘留分析要求，完全適用于獼猴桃氯吡脲殘留分析。

表4 實(shí)驗(yàn)回收率和精確度

2.5 眉縣獼猴桃中氯吡脲殘留量

表5顯示，眉縣獼猴桃主栽區(qū)和主要栽植品種在浸蘸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑80 d后即8月上旬前后果品氯吡脲殘留量0.025～0.058 mg·kg-1，其中徐香品種既有最高值也有最低值，小法儀鎮(zhèn)測(cè)定的2個(gè)品種含量都較高，浸蘸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑90 d、100 d氯吡脲殘留量高低也呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)，表明獼猴桃果品氯吡脲殘留量高低與品種沒(méi)有必然聯(lián)系，可能與栽植區(qū)域即地形地勢(shì)和小氣候有關(guān)。

表5 眉縣獼猴桃果品氯吡脲含量

所測(cè)定的全部樣品氯吡脲殘留量從浸蘸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑80 d后的0.025～0.058 mg·kg-1、平均0.039 mg·kg-1，降低到90 d后(8月中旬)的0.008～0.033 mg·kg-1、平均0.018 mg·kg-1，降幅為40.4%～68.0%、平均55.0%；又從90 d后降低到100 d后(8月下旬)的0.002～0.016 mg·kg-1、平均0.006 mg·kg-1，降幅為51.5%～75.0%、平均68.1%；表明隨著生長(zhǎng)，果品的氯吡脲殘留量逐步降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)降低幅度加大，原因可能有二，一是藥物自身的代謝衰減，二是生長(zhǎng)后期獼猴桃果實(shí)進(jìn)一步增重，對(duì)藥物殘留濃度起到了稀釋作用。

所測(cè)定的全部樣品氯吡脲殘留量在蘸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑90 d、100 d后都低于我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)(0.05 mg·kg-1)，且分別只有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值的16.0%～66.0%(平均36.3%)、4.0%～32.0%(平均12.5%)，即使是殘留量較高的蘸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑80 d也只有1個(gè)樣品高于我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明眉縣獼猴桃果品氯吡脲殘留量在8月中旬以后合格、安全。

3 結(jié)論與討論

(1)本研究確定的獼猴桃果品氯吡脲殘留量測(cè)定方法步驟為：稱取均質(zhì)樣品5.0 g放入50 ml塑料離心管內(nèi)，加入10 ml乙腈(分析純)渦旋提取2 min，超聲5 min，以6 000 r·min-1離心5 min，取上清液到另一離心管中備用；再用10 ml乙腈試劑對(duì)原樣品殘?jiān)鼫u旋提取一次，離心取全部上清液與第一步的提取液合并，向合并后的提取液中加入2 g氯化鈉，渦旋混勻，離心后取適量上層提取液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

(2)眉縣獼猴桃果品浸蘸氯吡脲類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑80、90、100 d后，氯吡脲殘留量依次為0.025～0.058、0.008～0.033、0.002～0.016 mg·kg-1，除80 d后1個(gè)樣品高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)外，其余批次均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，食用安全，尤其是施藥后100 d的殘留量非常低，僅為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(0.05 mg·kg-1)的4.0%～32.0%(平均12.5%)。

(3)相關(guān)研究表明[13], 獼猴桃中氯吡脲的代謝消解符合非線性一級(jí)動(dòng)力學(xué)消解模式，浸蘸后27 d之內(nèi)殘留量急劇下降，消解率達(dá)到60%～80%,不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)消解率有顯著影響，不同施藥濃度、不同品種對(duì)消解率影響不顯著。眉縣獼猴桃生產(chǎn)中絕大多數(shù)農(nóng)戶只在5月中旬(開(kāi)花后30～40 d)、嚴(yán)格按藥品使用說(shuō)明對(duì)幼果浸蘸氯吡脲類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，同時(shí)2020年眉縣政府有關(guān)部門(mén)規(guī)定并監(jiān)督檢查“8月25日之前禁止采摘銷售，8月25日之后分品種視成熟情況采摘”,可確保獼猴桃幼果浸蘸氯吡脲類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后有100 d以上的生長(zhǎng)期，并完全達(dá)到國(guó)家規(guī)定的氯吡脲殘留量安全標(biāo)準(zhǔn)。目前市場(chǎng)上可用于獼猴桃生產(chǎn)的氯吡脲類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合格產(chǎn)品，對(duì)提高產(chǎn)量、改善商品性、促進(jìn)果農(nóng)增收等作用明顯，科學(xué)使用氯吡脲類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不失為一種高效安全的方式。