王 鑫,劉大軍,郭盈盈,張佳琳,張曉莉*

0 引言

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以侵蝕性、對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的一種慢性、全身性自身免疫性疾病,RA的主要病理機(jī)制是軟骨基質(zhì)的降解,在RA中,參與關(guān)節(jié)降解的主要細(xì)胞類(lèi)型有滑膜纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞(Synovial fibroblast-like cells)、軟骨細(xì)胞(Chondrocytes)和破骨細(xì)胞(Osteoclasts)[1],這些細(xì)胞通過(guò)分泌蛋白水解酶和/或吞噬細(xì)胞外基質(zhì)成分來(lái)破壞軟骨和軟骨下骨[2]。許多證據(jù)表明,膠原蛋白水解酶和組織蛋白酶(Cathepsin,Cat)是降解軟骨和骨中主要蛋白成分的關(guān)鍵蛋白酶,Cat缺乏小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度較低[3],Cat S敲除小鼠關(guān)節(jié)炎的易感性較低[4],Cat K可能參與了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解,其抑制劑可能是未來(lái)治療慢性關(guān)節(jié)炎的一種重要選擇。本文將對(duì)Cat S和Cat K的生物學(xué)特征及其在RA中的作用進(jìn)行綜述。

1 RA的病理改變

RA的基本病理表現(xiàn)是滑膜炎,其特征是大量淋巴細(xì)胞的流入。淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和通過(guò)滑膜的遷移需要局部基質(zhì)的降解。RA患者的臨床表現(xiàn)主要是異常的免疫和炎癥反應(yīng),但發(fā)病機(jī)制尚未闡明。但已知的是RA的發(fā)病機(jī)制并不是由單一的一種細(xì)胞構(gòu)成,而是由多種類(lèi)型細(xì)胞共同參與,主要包括肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,其次還有T細(xì)胞[5]、B細(xì)胞[6]、樹(shù)突狀細(xì)胞[7]、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等。正常滑膜中肥大細(xì)胞約占滑膜表面細(xì)胞的3%;而在RA患者滑膜中其數(shù)量增長(zhǎng)了5～24倍,這些細(xì)胞于血管翳、軟骨交界處及血管翳侵入骨皮質(zhì)處過(guò)度表達(dá)[8],說(shuō)明肥大細(xì)胞在RA疾病中起著重要作用。而肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞是Cat S的兩個(gè)主要來(lái)源,其也可以由小膠質(zhì)細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生。Cat K高表達(dá)于纖維母細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞、軟骨破骨細(xì)胞和多核巨細(xì)胞,雖然早期的研究表明Cat K只在破骨細(xì)胞中表達(dá),但最近的研究揭示了更廣泛的分布模式。除了在破骨細(xì)胞、相關(guān)的軟骨細(xì)胞和多核巨細(xì)胞中表達(dá)外,單核細(xì)胞作為破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞,Cat K在單核細(xì)胞中也有表達(dá)[9]。

2 組織蛋白酶的生物學(xué)特性

Cat是一類(lèi)溶酶體蛋白酶,在機(jī)體內(nèi)參與蛋白降解、抗原提呈、細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程,且與腫瘤、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牙周炎等疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。人Cat K和Cat S屬于Cat家族,Cat家族在人類(lèi)細(xì)胞中有11個(gè)成員[10],這些酶具有緊密的三維結(jié)構(gòu),因而具有相同的催化機(jī)制和重疊底物特異性[11]。它們主要參與酸性溶酶體和/或內(nèi)核室小體內(nèi)的內(nèi)吞蛋白的終末降解[12-13]。

2.1 組織蛋白酶S的生物學(xué)特性 Cat S是一種屬于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶[12],由炎癥誘導(dǎo)[13]。1992年,人類(lèi)Cat S首次從肺泡巨噬細(xì)胞中被提取出來(lái)。其分布具有組織特異性,主要存在于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中,也多在表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(Major histocompatibility complex Ⅱ,MHCⅡ)的細(xì)胞中表達(dá)。Cat S能分解抗原和抗菌肽[14]，在抗原處理和表達(dá)過(guò)程中很重要。在細(xì)胞外,Cat S在中性環(huán)境下保持穩(wěn)定和活性,對(duì)多種蛋白具有催化水解活性,主要負(fù)責(zé)處理外圍樹(shù)突狀細(xì)胞中的不變鏈[15],特別是MHC II的恒定鏈和細(xì)胞外基質(zhì)成分[16],其次，Cat S作為一種彈性酶，能夠破壞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如膠原蛋白和細(xì)菌外膜蛋白[17]。因此,Cat S在MHC II處理以及T細(xì)胞刺激中發(fā)揮重要作用。

2.2 組織蛋白酶K的生物學(xué)特性 Cat K類(lèi)似于木瓜蛋白酶,是一種重要的骨吸收蛋白酶,在骨吸收破骨細(xì)胞中構(gòu)成主要的蛋白水解活性[13],被認(rèn)為是破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收的關(guān)鍵蛋白酶。Cat K在滑膜層及滑膜下區(qū)域的表達(dá)最為明顯,參與了軟骨的降解。Cat K缺乏會(huì)導(dǎo)致結(jié)節(jié)病,一種硬化性骨發(fā)育不良,這一發(fā)現(xiàn)支持了上述結(jié)論[12]。Cat K可能有助于抗原的處理和/或表達(dá),并通過(guò)軟骨中的糖胺聚糖選擇性調(diào)節(jié)酶的膠原降解活性[18]。

3 組織蛋白酶在RA發(fā)病中的作用

Cat K和Cat S在細(xì)胞外基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)的各個(gè)方面都有作用。Cat S參與了MHC II類(lèi)抗原的表達(dá)。它可能還具有蛋白聚糖降解活性,在中性和酸性環(huán)境中發(fā)揮強(qiáng)大的水解軟骨聚集蛋白聚糖的作用[19]。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞分泌成熟Cat K,提示Cat K可能參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解,Cat K表達(dá)的增加主要與類(lèi)滑液成纖維細(xì)胞群在RA標(biāo)本的滑液下和血管周?chē)鷧^(qū)域的擴(kuò)張有關(guān),提示該蛋白酶可能在該疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。相比之下,Cat S主要存在于巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中,在抗原呈遞和基質(zhì)降解方面具有雙重功能[6]。

3.1 組織蛋白酶的作用機(jī)制 Cat分解不變鏈(li)衍生的前肽Lip10(p10),最終將片段(ii類(lèi)相關(guān)不變鏈肽)留在主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)上。由于只有剪切加載的MHC II分子才能在吞噬溶酶體內(nèi)加載外源性肽序列,所以，Cat的分裂活性對(duì)CD4 T細(xì)胞的抗原呈遞至關(guān)重要。這表明,Cat S可能是破壞軟骨細(xì)胞分泌的MHC II的主要因素,因此,推測(cè)提高Cat的活性可能會(huì)導(dǎo)致MHC II表達(dá)和自身免疫水平升高,而抑制Cat可能是一種抑制MHC II介導(dǎo)的T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)的新方法。由于抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell,APC)中p10的分裂只發(fā)生在Cat身上,因此，細(xì)胞內(nèi)p10的積累是一個(gè)有效的Cat抑制的生物標(biāo)志物[20]。

3.2 組織蛋白酶S與RA疾病活動(dòng)呈正相關(guān) 如上所述,Cat S和Cat K參與了細(xì)胞外基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)的各個(gè)方面,近年的研究發(fā)現(xiàn),Cat S可能通過(guò)其蛋白水解活性、調(diào)控滑膜炎癥及骨破壞參與了RA的發(fā)病。趙進(jìn)軍等[21]在相關(guān)研究中使用兩個(gè)品系的小鼠,在C57BL/6小鼠中發(fā)現(xiàn)了血清中Cat S的水平在膠原抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagenantibody induced arthritis,CAIA)組明顯升高,且踝關(guān)節(jié)滑膜中Cat S的表達(dá)明顯升高,尤其在肥大細(xì)胞激活劑C48/80組更加顯著,而使用肥大細(xì)胞的膜穩(wěn)定劑DSCG可使Cat S的表達(dá)下降。因此認(rèn)為在肥大細(xì)胞敲除的KitW-sh/W-sh小鼠中使用抗Ⅱ型膠原抗體不能誘導(dǎo)CAIA模型,而加用外源骨髓源性肥大細(xì)胞(Bone marrow derivedmast cells,BMMCs)后可成功誘導(dǎo)模型。

Cat S高表達(dá)于RA患者的滑膜中,包括CD68+巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞、交叉細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,臨床發(fā)現(xiàn),Cat S與RA的臨床活動(dòng)密切相關(guān),血清中Cat S的表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照組(健康體檢者),而且其表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)度(DAS-28)正相關(guān),并與RF水平相關(guān),但與抗CCP抗體的基線水平無(wú)關(guān)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn),在體外共培養(yǎng)小鼠BMMCs和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞時(shí),用C48/80激活的BMMCs可破壞軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原,而加入Cat S的特異性抑制劑LHVS和非特異性抑制劑E64后,軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原量恢復(fù)[22],這說(shuō)明Cat S對(duì)軟骨細(xì)胞尤其是膠原表達(dá)有一定的負(fù)向調(diào)控作用。

Cat L、Cat S和MMP-3在RA患者關(guān)節(jié)腔積液(SF)中的水平明顯高于血清。ACPA、IgM-RF和IgA-RF患者的血清Cat水平均顯著高于無(wú)這些抗體的患者。ACPA和RF陽(yáng)性患者中,兩種組織蛋白酶的血清水平與DAS28和CRP相關(guān),而在血清陰性患者中不相關(guān);ACPA陽(yáng)性和ACPA陰性、IgA和IgM陽(yáng)性和陰性患者的Cat S和Cat L的循環(huán)水平存在顯著差異[23]。有自身抗體和沒(méi)有自身抗體的RA患者Cat S和Cat L的差異表明,這些Cat在血清陽(yáng)性RA的疾病過(guò)程中有特定的作用。在該表型中,Cat血清水平可能反映自身免疫活性,而血清水平可能反映關(guān)節(jié)局部炎癥和基質(zhì)降解過(guò)程。其他文獻(xiàn)報(bào)道了ACPA陽(yáng)性RA患者血清Cat K水平升高,這支持了ACPA抗體誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的假說(shuō),并且是自身免疫和關(guān)節(jié)破壞之間的直接聯(lián)系[23]。由此可見(jiàn),自身抗體與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的RA患者骨吸收的Cat之間有很強(qiáng)的特異性關(guān)聯(lián)[21]。在一定程度上提示,Cat S可能參與RA的疾病過(guò)程。

3.3 組織蛋白酶S/K調(diào)控RA滑膜炎癥和骨破壞 RA軟骨侵蝕是由激活的軟骨細(xì)胞、覆蓋在滑膜上的軟骨和透明軟骨的軟骨下細(xì)胞浸潤(rùn)所引起的三向過(guò)程。軟骨下骨主要由骨/軟骨細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和單核前體細(xì)胞降解。研究發(fā)現(xiàn),核因子κB配體(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)藥物對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞的靶向可能足以抑制RA中破骨細(xì)胞的活性和防止骨破壞[22]。Cat S存在于RA患者關(guān)節(jié)的滑膜巨噬細(xì)胞中,分泌蛋白酶進(jìn)入軟骨基質(zhì)引起炎性反應(yīng),軟骨聚集蛋白聚糖-C II網(wǎng)狀組織的完整性可能被破壞[24],從而參與RA的滑膜炎癥。Cat K高表達(dá)于侵襲滑膜巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞,提示該蛋白酶參與了RA的軟骨侵蝕[19]。Cat K缺乏會(huì)導(dǎo)致骨硬化性疾病(致密性成骨不全癥),在分子水平上,其特征是在骨重建過(guò)程中I型膠原降解不足,這證明Cat K在骨破壞及骨重建中起到關(guān)鍵作用。

4 組織蛋白酶在其他疾病中的作用

4.1 組織蛋白酶與干燥綜合征(Sjogren syndrome,SS) 有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在SS患者淚液中存在有活性的Cat S,其活性大于RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)和健康對(duì)照者淚液中Cat S的活性。SS患者淚液中發(fā)現(xiàn)的Cat S促進(jìn)了乳鐵蛋白(LF)和分泌IgA(SIgA)這兩種豐富的淚蛋白的降解,這兩種蛋白在眼睛防御病原體方面都起著至關(guān)重要的作用[25]。

4.2 組織蛋白酶與系統(tǒng)性紅斑狼瘡 Cat S通過(guò)驅(qū)動(dòng)MHC II類(lèi)介導(dǎo)的T細(xì)胞和B細(xì)胞啟動(dòng)、生發(fā)中心形成和B細(xì)胞向漿細(xì)胞成熟來(lái)促進(jìn)SLE。這些傳入免疫途徑可以被Cat S拮抗劑RO5461111特異性逆轉(zhuǎn),即使在疾病發(fā)作后給予Cat S拮抗劑,也能阻止SLE及狼瘡性腎炎的進(jìn)展,這種新的治療策略可以糾正SLE及其他免疫復(fù)合物相關(guān)自身免疫性疾病的共同病理機(jī)制[26]。

4.3 組織蛋白酶與心血管及呼吸系統(tǒng)疾病 在心血管疾病中,有研究者認(rèn)為，Cat S 和Cat B可作為心血管疾病的標(biāo)志物,當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞受IL-1β和IFN-γ刺激時(shí),會(huì)分泌Cat S,并降解不溶性彈性蛋白,進(jìn)而破壞動(dòng)脈粥樣斑塊在血管中的穩(wěn)態(tài)。Cat S通過(guò)彈性蛋白的裂解和生物活性彈性蛋白肽的生成,促進(jìn)心血管炎癥和鈣化。在心血管鈣化中,鈣和磷酸鹽的失衡以及Cat S的升高,可能會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞(包括血管SMCs和間質(zhì)細(xì)胞)向骨軟骨源性或僵硬表型轉(zhuǎn)化[27],這種機(jī)制有助于鈣化主動(dòng)脈瓣膜疾病的發(fā)展。

Cat S在呼吸系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮一定作用,有研究發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的發(fā)病機(jī)制與Cat S也有關(guān)系,Cat S在COPD患者的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中高度表達(dá)。COPD患者支氣管肺泡灌洗液中Cat S水平和活性高于健康志愿者。肺氣腫小鼠模型的研究表明,Cat S促進(jìn)肺部炎癥和破壞[28]。與COPD相比,先前的一項(xiàng)研究表明,哮喘患者與健康體檢者相比,血漿Cat S的水平反而更低。血漿Cat S和Cat S/胱抑素C(Cys C)比值與氣流阻塞的程度和肺氣腫的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[29]。

5 組織蛋白酶抑制劑

5.1 組織蛋白酶S的抑制劑 迄今為止,Cat S的靶向治療一直集中在Lip10上。在一項(xiàng)人類(lèi)臨床研究中,Cat S抑制劑RO5459072的劑量在Lip10中表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的增加,并在體內(nèi)顯示了預(yù)期的藥理學(xué)抑制作用?；舴蚵?拉羅什的研究旨在治療與MHC II肽負(fù)荷相關(guān)的自身免疫性疾病,證實(shí)了RO5459072是一種選擇性的、有效的、競(jìng)爭(zhēng)性的口服抑制劑,其活性位點(diǎn)可以減少CD4 T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的激活以及自身抗體的產(chǎn)生,在臨床前模型的自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡和狼瘡腎炎中有很明顯的效果[30]。

有研究顯示,特異性抑制劑RO5459072在PBMC體外抑制Cat S,導(dǎo)致Lip10在B細(xì)胞和mDC中積累,但在pDC中沒(méi)有,在單核細(xì)胞中只有很小程度的積累。抗原特異性激活CD4輔助T細(xì)胞和下游激活效應(yīng)機(jī)制,如B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體,在RA和SS等多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用已得到證實(shí)。因此，抑制Cat S可能有效地治療炎癥Th1驅(qū)動(dòng)、mDC或B細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的自身免疫過(guò)程,如銀屑病或多發(fā)性硬化癥,同時(shí)保持耐受性pDC功能[31]。

5.2 組織蛋白酶K的抑制劑 Cat K通過(guò)破骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá),降解骨和軟骨的關(guān)鍵成分,如I型和II型膠原蛋白、骨連接蛋白[28]。由于Cat K抑制劑(Cathepsin K inhibitors,CKIs)可以選擇性地抑制骨吸收,但對(duì)骨形成的影響較小,因此在之前的研究中,CKIs已被用于治療骨質(zhì)疏松癥。Cat K在RA的滑膜成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)。放射破壞的程度與Cat K的血清水平之間存在正相關(guān)的關(guān)系。抑制Cat K蛋白酶活性可能有助于預(yù)防RA的骨侵蝕和軟骨降解。CKIs可能抑制全身和局部骨質(zhì)流失,改善關(guān)節(jié)炎,并降低骨強(qiáng)度下降的動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)炎[32]。

在體外實(shí)驗(yàn)中,ONO-5334顯示出對(duì)Cat K的強(qiáng)選擇性抑制作用,并在骨質(zhì)疏松模型中導(dǎo)致骨密度和骨強(qiáng)度的改善。Drake等[33]在臨床研究中調(diào)查了該化合物對(duì)絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的療效和安全性,研究顯示，ONO-5334組和阿侖膦酸鈉組的腰椎、全髖關(guān)節(jié)和股骨頸的骨密度均顯著升高。

Cat抑制劑的研究,在一定程度上對(duì)于未來(lái)RA及許多其他自身免疫性疾病的治療有著重要意義,可實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期治療的目的,減輕患者病痛,提高生活質(zhì)量。

6 小結(jié)與展望

RA是風(fēng)濕科眾多疾病中較為常見(jiàn)的病種之一,由于疾病后期會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、功能喪失等一系列影響患者生活質(zhì)量的并發(fā)癥,早期干預(yù)顯得尤為重要。近幾年,Cat成為研究RA的熱點(diǎn)。Cat具有廣泛的生物學(xué)活性,參與了基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)的各個(gè)方面。在RA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,血清Cat S的表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照組,其表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)度(DAS-28)正相關(guān),有自身抗體的患者的血清Cat水平均顯著高于無(wú)這些抗體的患者,RA患者SF中Cat水平明顯高于血清中的水平。Cat缺乏小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度降低,Cat S敲除小鼠關(guān)節(jié)炎的易感性降低,提示Cat抑制劑可能成為RA新的治療靶點(diǎn),Cat S的特異性抑制劑LHVS和非特異性抑制劑E64,可能對(duì)軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原有抑制降解的作用。在Svelander等[34]在食蟹雌猴的研究中，發(fā)現(xiàn)抑制Cat K可減少膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)[35]小鼠模型的骨侵蝕、軟骨退化和炎癥。ONO-5334是一種低分子量的Cat K合成抑制劑,可抑制關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)展,與甲氨蝶呤(MTX)同時(shí)使用可增強(qiáng)其效果,因此,ONO-5334與MTX聯(lián)合應(yīng)用可能有助于治療RA。但由于觀察時(shí)間及生物物種等因素,加之Cat S同源性較高,對(duì)其他Cat可能也會(huì)產(chǎn)生抑制作用,而且許多抑制劑的特異性較低,因此,研究并開(kāi)發(fā)一種特異性高、不良反應(yīng)小的Cat S抑制劑是研究的難點(diǎn)。應(yīng)用Cat拮抗劑治療RA能否達(dá)到理想的效果尚不明確,仍需對(duì)Cat的生物學(xué)特性及其在RA的發(fā)病機(jī)制中的作用深入研究,或許在將來(lái)對(duì)于RA的治療甚或治愈有著重要意義。