馮協(xié)和，戢太陽(yáng)，劉 菁

0 引言

及己[Chloranthusserratus(Thunb.)Roem et Schult]為金粟蘭科(Chloranthaceae)植物[1]，因其葉常常四枚聚集，故又名“四塊瓦”、“白四塊瓦”或“四葉對(duì)”等[2]。及己的藥用部位為根、根莖或全草，具有活血散瘀、祛風(fēng)止痛、消腫解毒等功效，臨床上多用于治療跌打損傷、風(fēng)濕疼痛、疔瘡腫毒等[3]。及己的化學(xué)成分主要有倍半萜類、二萜類、香豆素類、酰胺類、酚類[4]。研究證明，香豆素類成分是金粟蘭科植物發(fā)揮抗菌消炎作用的主要成分[5]，傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶即是及己香豆素類成分中的2種。被《中國(guó)藥典》收錄的及己同科藥材腫節(jié)風(fēng)將異嗪皮啶作為含量測(cè)定的指標(biāo)之一[6]。因此,測(cè)定及己中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量對(duì)于其質(zhì)量控制具有重要意義。目前對(duì)于及己的研究主要集中于基源鑒別和成分研究[7-9]，但對(duì)于其質(zhì)量控制，尚缺乏相關(guān)研究。故本試驗(yàn)建立了HPLC-DAD法測(cè)定及己不同部位(根、莖、葉)中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量，以期為及己藥材的質(zhì)量控制和及己資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DIONEX)(四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器)，LGC-1025M型柱溫箱及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站;AE523型電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司d=0.001 g);MS105型電子分析天平(METTLER TOLEDO d=0.01mg);DFT-100型手提式粉碎機(jī)(上海新諾儀器設(shè)備有限公司，功率：400 W);HT-9013A型電熱恒溫干燥箱(東莞華臺(tái)測(cè)試儀器有限公司);DS-5510DT超聲波清洗機(jī)(上?；涊x貿(mào)易發(fā)展有限公司，清洗頻率：40 kHz)。

1.2 試藥 及己樣品分2次(采集時(shí)間2018年5月8日和2018年5月17日)采自湖北省丹江口市六里坪鎮(zhèn)，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院陳吉炎教授鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物及己。傘形花內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：100615-201604，純度：98.94%)、異嗪皮啶對(duì)照品(批號(hào)：110821-201501，純度：99.20%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);磷酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理 從2次采集的及己樣品中分別選取6株完好的植株，共選取12株，要求選取的植株的生長(zhǎng)年限一致。將選取植株的根、莖和葉分離，每2個(gè)單株作為1個(gè)樣品，共得到根、莖和葉樣品各6份，分別編號(hào)為及己根1～6號(hào)樣品、及己莖1～6號(hào)樣品、及己葉1～6號(hào)樣品。將得到的樣品清除雜質(zhì)，于電熱恒溫干燥箱中鼓風(fēng)干燥，用粉碎機(jī)粉碎并過60目篩、備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶對(duì)照品適量，用甲醇溶解后制成質(zhì)量濃度分別為10.5、60.3 μg/ml的溶液，用0.22 μm濾膜過濾，濾液即為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取及己根、莖和葉的粉末樣品2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 ml，采用加熱回流法提取1.5 h，放冷后再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。補(bǔ)足重量后搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 ml置10 ml量瓶中用甲醇定容，搖勻。取適量經(jīng)微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)，進(jìn)行梯度洗脫：0～5 min，10%～20%A;5～15 min，20%～30%A;15～30 min，30%～40%A;30～35 min，40%～55%A;35～45 min，55%～10%A。流速：1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μl。

在上述色譜條件下，進(jìn)樣“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下及己根供試品溶液。結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯保留時(shí)間約為12.3 min;異嗪皮啶保留時(shí)間約為37.2 min;理論塔板數(shù)均不低于9 000;供試品色譜峰的DAD匹配值不低于999.17，說明供試品溶液中的傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶色譜峰與其相鄰的色譜峰分離較好。見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)與供試品(B)HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，分別用甲醇稀釋成傘形花內(nèi)酯0.328 1、0.656 3、1.312 5、2.625、5.25、10.5 μg/ml，異嗪皮啶1.884、3.769、7.537 5、15.075、30.15、60.3 μg/ml系列對(duì)照品溶液。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量20 μl，記錄峰面積。以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制這2種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的回歸方程。其線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。

表1 傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶回歸方程和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下含傘形花內(nèi)酯10.5 μg/ml、異嗪皮啶60 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定次數(shù)為6次，記錄傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.04%和1.17%，均在2%范圍內(nèi)，說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取及己根3號(hào)樣品、及己莖1號(hào)樣品、及己葉4號(hào)樣品各6份，準(zhǔn)確稱定后制備供試品溶液，制備方法如“2.2.2”項(xiàng)下所述，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量20 μl，記錄傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果顯示，及己根中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.24%、1.38%，及己莖中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.74%、1.16%，及己葉中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.46%、1.89%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取及己根2號(hào)樣品、及己莖1號(hào)樣品、及己葉3號(hào)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果顯示，及己根中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.71%、1.24%，及己莖中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.39%、1.08%，及己葉中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.25%、1.62%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取及己根2號(hào)樣品6份，每份1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 ml，再加入含傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶分別為 10.5、60.3 μg/ml的對(duì)照品溶液5 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定 分別稱取及己根1～6號(hào)樣品、及己莖1～6號(hào)樣品、及己葉1～6號(hào)樣品各2 g，準(zhǔn)確稱定后制備供試品溶液，制備方法如“2.2.2”項(xiàng)下所述。制備好的供試品溶液按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 及己不同部位中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量(n=6)

3 討論

3.1 樣品的采集 武當(dāng)山地區(qū)民間具有較久的及己使用歷史，常用其治療跌打損傷、瘀血水腫[10]，且前期針對(duì)鄂西的及己已有一定研究[1,9-10]。根據(jù)《全國(guó)中草藥匯編》，及己的采集加工為夏、秋采挖全草，洗凈，曬干[11]，故本文選擇5月采集湖北武當(dāng)山地區(qū)的及己進(jìn)行研究，研究樣本采集具有一定代表性，但針對(duì)全國(guó)其他地區(qū)和不同采樣時(shí)間對(duì)及己成分的影響，課題組將進(jìn)行下一步研究。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 二極管陣列檢測(cè)器(DAD)具有靈敏度高、噪音低、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，通過DAD檢測(cè)可以繪制時(shí)間、光強(qiáng)度、波長(zhǎng)的三維譜圖。試驗(yàn)中對(duì)傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶對(duì)照品溶液用DAD檢測(cè)器進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在 320 nm波長(zhǎng)下傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶均有較強(qiáng)吸收，故決定檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

3.3 流動(dòng)相的確定 試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相體系和比例進(jìn)行了大量摸索。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-16]，分別探索了乙腈-0.1% 磷酸溶液和甲醇-0.1% 磷酸溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相對(duì)及己樣品的分離效果更好。但以甲醇-0.1% 磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)，傘形花內(nèi)酯和相鄰的雜質(zhì)峰仍分離不好，故課題組改變了甲醇和0.1%磷酸溶液的比例，采用梯度洗脫，并通過調(diào)節(jié)流速，控制柱溫，實(shí)現(xiàn)了各峰的較好分離。最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.1% 磷酸溶液，并按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 提取方法的選擇 本試驗(yàn)主要提取成分為傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶，根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]，不同提取方法的提取效率不同。為確定及己中此2種成分的提取方法，課題組分別對(duì)比了索氏提取法，超聲提取法和加熱回流法的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加熱回流法提取的含量較另2種方法更高，此結(jié)果與洪菁[19]的研究基本一致。此外，課題組探索了提取時(shí)間(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示，及己3個(gè)部位的提取方法都可以確定為加熱回流法，甲醇作為溶劑，提取時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶25。

3.5 含量測(cè)定結(jié)果 通過及己各部位傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量測(cè)定結(jié)果可知，及己根中的傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶含量最高，分別為0.063 08、0.316 50 mg/g。其中，根、莖、葉中傘形花內(nèi)酯的含量無(wú)顯著差異，但異嗪皮啶含量差異較大。根中異嗪皮啶的含量分別是莖、葉的9倍和17倍，此結(jié)果與袁琴琴等[14]研究的同屬植物銀線草不同部位異嗪皮啶含量的差異相同。測(cè)定結(jié)果說明，及己藥材中的傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶主要存在于根中。雖然及己不同部位的傘形花內(nèi)酯含量差異不大，但由于異嗪皮啶含量差異較大，故在使用及己時(shí)，應(yīng)對(duì)其不同部位的藥理活性和臨床應(yīng)用進(jìn)行區(qū)別，以達(dá)到最好使用效果。

4 結(jié)論

本研究建立了HPLC-DAD法測(cè)定及己不同部位傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶含量的方法，試驗(yàn)結(jié)果顯示，及己不同部位中傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量次序?yàn)椋焊?莖>葉。實(shí)驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性高，可為及己藥材的資源開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。