溫慶輝,徐軍發(fā),李燕嫦,黃金印

0 引言

隨著抗菌藥物種類增加,抗菌藥物濫用等情況導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生,并且變化速度快[1]。肺炎克雷伯菌是革蘭陰性菌,腸桿菌科屬,屬于條件致病菌,能夠引起消化系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染和呼吸道感染等,其也是導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要原因之一[2]。近年來,廣譜抗菌藥物使用范圍擴(kuò)大,肺炎克雷伯菌對多數(shù)一線藥物產(chǎn)生耐藥性,其耐藥機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶、AmpCβ內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶等[3- 4]。耐藥菌株常同時攜帶碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氯霉素、磺胺類等耐藥基因,具有多種耐藥機(jī)制,呈多重耐藥的特點(diǎn)。

乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)是一種金屬螯合劑,曾被用于治療鉛、汞等中毒。由于其能隔絕鎂離子、鈣離子、鐵離子、鋅離子,也被作為滲透劑及加強(qiáng)劑用于治療與醫(yī)療設(shè)備、牙科、獸醫(yī)類有關(guān)的有菌膜生長的傷口,其能夠增加細(xì)菌細(xì)胞壁厚度,引起菌膜萎縮,發(fā)揮治療作用。研究表明,EDTA能夠控制尿道、血管內(nèi)細(xì)菌菌膜的生長,減少感染發(fā)生,也能結(jié)合活性物質(zhì)如抗生素、乙醇、碘、銀等控制菌膜、微生物生長[5-6]。目前,關(guān)于EDTA在恢復(fù)多重耐藥肺炎克雷伯菌對部分抗菌藥物敏感性中的作用的研究較少。本研究選取多重耐藥肺炎克雷伯菌患者作為研究對象,分析不同濃度EDTA在恢復(fù)多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星3種藥物敏感性中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2018年1月至2019年12月產(chǎn)ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌感染患者36例,其中男23例,女13例,平均年齡(50.67±5.94)歲;根據(jù)不同感染部位分布,呼吸道感染及泌尿道感染最常見,其次是消化道與切口部位;其中肺部感染16例,泌尿系感染11例,腹部感染5例,傷口感染4例。藥敏報告顯示，對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星3種藥物敏感。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 試劑 EDTA注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號:0504091);哌拉西林他唑巴坦鈉(國藥準(zhǔn)字J20150041,惠氏制藥有限公司);阿米卡星(國藥準(zhǔn)字H23021795,哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司);左旋氧氟沙星(國藥準(zhǔn)字H20010538,江蘇漣水制藥有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 體內(nèi)治療與觀察 采取倍比稀釋法配置高、中、低3種不同濃度的EDTA[高濃度EDTA注射液1g，qd(出廠成品);中濃度EDTA注射液0.5 g,qd(經(jīng)1∶2稀釋而成);低濃度EDTA注射液0.25 g,qd(經(jīng)1∶4稀釋而成)],分別將患者隨機(jī)分為低濃度組、中濃度組及高濃度組，各12例,觀察臨床療效及不良反應(yīng)。

1.3.2 體外藥敏試驗(yàn)和生物膜抑制試驗(yàn) 先將受試藥物配成相應(yīng)濃度的溶液,然后采取瓊脂平皿二倍稀釋法,分受試藥物組、受試藥物+低EDTA組、受試藥物+中EDTA組、受試藥物+高EDTA組,各組平皿加入2 mmol/L的106cfu/ml,分別測定產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯桿菌的MIC。

1.3.3 生物膜抑制試驗(yàn) 將LB肉湯培養(yǎng)18 h的肺炎克雷伯菌用新鮮LB肉湯(0.25% 葡萄糖)按1∶1 200比例稀釋。將 0.2 ml稀釋后的菌液加入96孔平底組織培養(yǎng)盤,每株分別移入4個平行孔。在37 ℃培養(yǎng)18 h后,用移液器吸頭吸干每孔菌液,然后用PBS(pH7.2)緩沖液洗板3次,然后用Bouin固定液固定,用結(jié)晶紫染色,洗去未黏附細(xì)菌,晾干,每孔加入200 μl丙酮乙醇,微振蕩,酶標(biāo)儀檢測每孔的A570 nm值。生物膜形成陽性株篩選條件為:陰性對照菌株平均A值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為界定值,以平均A值大于界定值為生物膜形成株。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌MIC測定 哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星加入EDTA后,肺炎克雷伯菌MIC降低,敏感性恢復(fù)。與受試藥物組比較,低、中、高濃度EDTA組MIC顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與低濃度EDTA相比,中、高濃度EDTA組MIC顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與中濃度EDTA相比,高濃度EDTA組MIC降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 肺炎克雷伯桿菌MIC測定(mg/L,n=20)

2.2 EDTA增強(qiáng)抗菌藥物對肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制作用 哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星加入EDTA后,肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制作用降低。與空白組相比,受試藥物組及低、中、高濃度EDTA組抑制作用顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與受試藥物組相比,低、中、高濃度EDTA組抑制作用顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與低濃度EDTA相比,中、高濃度EDTA組抑制作用顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 EDTA增強(qiáng)抗菌藥物對肺炎克雷伯桿菌生物膜形成的抑制作用(n=9)

3 討論

多重耐藥菌是指對β-內(nèi)酰胺類、紅霉素、氨基糖苷類3種或3種以上的抗菌藥物均耐藥,耐藥菌株呈逐漸上升趨勢,其以產(chǎn)革蘭陰性菌最為普遍。目前,多重耐藥菌已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn),關(guān)于多重耐藥細(xì)菌感染患者治療仍是臨床治療難點(diǎn)。病原學(xué)隨著病情、環(huán)境的不同發(fā)生變化,臨床感染的多重耐藥菌分布也發(fā)生了改變。近年來,對多重耐藥的抗菌藥物敏感性的恢復(fù)作用引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,并開展了一些研究,但不同濃度的EDTA是否能恢復(fù)抗菌藥物對多重耐藥菌敏感性方面,目前國內(nèi)研究甚少。

肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制:①藥物滅活酶:耐藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制。肺炎克雷伯菌屬于革蘭陰性菌,產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶,水解內(nèi)酰胺,破壞具有內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的抗菌藥物,使其喪失活性。肺炎克雷伯菌對新研發(fā)的抗菌類藥物，合成β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷鈍化酶等,作用于抗菌藥物,使其喪失活性,產(chǎn)生耐藥性[7]。②生物膜:細(xì)菌外膜未覆蓋被膜物質(zhì),當(dāng)所處環(huán)境惡劣時,肺炎克雷伯菌在細(xì)胞膜外生成膜,對抗不良因素,保護(hù)菌體,使肺炎克雷伯菌免受侵襲[8]。生物膜表面附著的物質(zhì),形成營養(yǎng)物質(zhì)的輸送渠道,保證營養(yǎng)充足供給細(xì)菌,與無生物膜細(xì)菌相比,其生理特征、侵襲力以及菌體形態(tài)等更有優(yōu)勢,對免疫系統(tǒng)攻擊產(chǎn)生抵抗力,導(dǎo)致抗菌藥物不能作用于菌體,引起藥物失效。③膜孔蛋白的缺失:肺炎克雷伯菌細(xì)胞膜上的通道由孔蛋白構(gòu)成,經(jīng)此通道為其提供良好的外界物質(zhì)。若膜孔蛋白發(fā)生改變,導(dǎo)致抗菌藥物無法滲入菌體內(nèi)部,不能發(fā)揮作用而失效[9]。④基因突變:對氟喹諾酮類產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制是DNA旋轉(zhuǎn)酶中CyrA 和拓?fù)洚悩?gòu)酶ParC的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致抗菌藥物無法同酶-DNA復(fù)合物結(jié)合,其抑制細(xì)菌DNA合成的作用受到阻止,出現(xiàn)耐藥性[10]。⑤細(xì)菌外排泵作用:肺炎克雷伯菌有向外界排泄有害物質(zhì)的系統(tǒng),該排泄系統(tǒng)排泄的物質(zhì)不具有特異性,多種菌株能夠構(gòu)成不同能力的排泄系統(tǒng),當(dāng)外排系統(tǒng)作用增加,對多種抗菌藥物外排增加,導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生強(qiáng)耐藥,即多重耐藥性[11-12]。Niu等[13]研究了EDTA與美羅培南聯(lián)合應(yīng)用的體外抗菌活性，結(jié)果顯示,EDTA濃度達(dá)到一定程度,美羅培南在低濃度抑菌率逐漸上升,美羅培南對于耐藥肺炎克雷伯菌在較低濃度就可以發(fā)揮良好的殺菌效果。

根據(jù)本文中產(chǎn)ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌感染部位及致病性的不同,發(fā)現(xiàn)機(jī)體發(fā)生呼吸道與泌尿道的感染幾率最高,對此細(xì)菌呈一定聚集度,藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果更易出現(xiàn)多重耐藥性,可能與本菌對人體的感染致病機(jī)制有關(guān),也與這兩個感染部位基礎(chǔ)疾病對相關(guān)抗菌藥物高耐受有一定的關(guān)系。應(yīng)根據(jù)相關(guān)感染部位的分布特點(diǎn)及耐藥情況有針對性地做好防控策略,對預(yù)防治療呼吸道、泌尿道、消化道及傷口感染等進(jìn)行合理用藥。

研究顯示,將左氧氟沙星、阿米卡星與 EDTA聯(lián)合治療肺炎克雷伯菌感染,治療有效率高,加用 EDTA使細(xì)菌MIC降低,對抗菌藥物的敏感性恢復(fù)[14]。本研究結(jié)果與上述報道結(jié)果相一致,不同濃度的EDTA能夠降低多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星抗菌藥物的MIC,恢復(fù)敏感性。中濃度以及高濃度EDTA能夠顯著降低MIC。在敏感性試驗(yàn)中,EDTA的抗菌作用已被證實(shí)有效,包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、酵母菌等[15]。細(xì)菌細(xì)胞膜、外膜上有親水性蛋白通道,允許通過親水性物質(zhì),有利于親水性藥物(如阿米卡星、左旋氧氟沙星)進(jìn)入。針對細(xì)菌的外排泵作用,EDTA可以與Ca2+、Mg2+等維持膜結(jié)構(gòu)、功能的成分絡(luò)合,導(dǎo)致細(xì)胞通透性、流動性增加。藥物濃度增加可以對抗降低的外膜滲透性以及藥物外排泵出增強(qiáng)導(dǎo)致的多種耐藥[16]。研究表明,EDTA對菌膜生長的抑制作用具有濃度差異,并且不同成分的EDTA、不同給藥方法對菌膜的抑制作用也存在差異性,EDTA通過破壞菌膜結(jié)構(gòu)加強(qiáng)抗菌藥物的臨床療效。根據(jù)EDTA能恢復(fù)多重耐藥肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的敏感性,明確基本控制策略,降低多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的發(fā)生率,并為臨床治療提供重要依據(jù),為治療多重耐藥菌開發(fā)新途徑。合理應(yīng)用抗菌藥物,有利于提高患者生存質(zhì)量,節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用,減輕患者家庭負(fù)擔(dān)[17-18]。

綜上所述,中、高濃度的EDTA能恢復(fù)多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星抗菌藥物的敏感性,為治療產(chǎn)ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌及研發(fā)新藥提供了可借鑒的方向。