王 婷,馮 琦,龍喜國(guó)

0 引言

腎病綜合征(Nephrotic syndrome,NS)是腎小球?yàn)V過(guò)膜損傷后基膜通透性增加的一種病理生理狀態(tài)[1]。由于血液白蛋白大量異常地通過(guò)腎小球滲入尿液,導(dǎo)致了血液白蛋白低下、血脂急劇增加和水腫等現(xiàn)象[2]。而尿蛋白的形成與腎小球?yàn)V過(guò)屏障損傷有關(guān),作為腎小球?yàn)V過(guò)的障礙,足細(xì)胞在腎病綜合征期間尿蛋白的形成中起重要作用[3],因此,足細(xì)胞可以作為治療腎病綜合征的關(guān)鍵靶標(biāo)。

沒(méi)食子酸(Gallic acid)是一種天然多酚類(lèi)化合物,其具有多種生物學(xué)活性,包括抗氧化、抗誘變、抗炎、抗癌以及保護(hù)心臟等[4-6]。目前,已有研究表明,沒(méi)食子酸不僅能夠保護(hù)質(zhì)膜的完整性,而且可以增加肝臟和腎臟的再生和修復(fù)能力,并對(duì)甲氨蝶呤引起的大鼠腎組織損傷具有保護(hù)作用[7]。因此,本研究通過(guò)阿霉素誘導(dǎo)建立腎病綜合征大鼠模型,探討沒(méi)食子酸對(duì)腎組織損傷和腎小球足細(xì)胞損傷中的干預(yù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 60只雄性SPF 級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重180～220 g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。室溫20～24 ℃,相對(duì)濕度40%～70%，適應(yīng)性普通飼料1周,自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要材料與試劑 腎小球足細(xì)胞株(MPC5)購(gòu)于上海弘順生物科技有限公司,阿霉素(ADR)購(gòu)自山西普德藥業(yè)股份有限公司,尿蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,CCK-8試劑盒、HE染色和免疫組化染色試劑均購(gòu)自上海碧云天生物研究所;胎牛血清、青霉素、鏈霉素與RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司,ECL化學(xué)發(fā)光液和BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司,抗體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、Nephrin、Podocin、Sirtl以及GAPDH購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自北京博奧森生物公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組、造模及給藥處理 60只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,取8只作為對(duì)照組,剩余52只建模。建模方法:大鼠在建模的第1、8天通過(guò)尾靜脈注射劑量分別為 4 mg/kg和1 mg/kg的阿霉素,對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水。注射后每隔1周收集1次24 h尿樣本,測(cè)定尿蛋白含量,當(dāng)24 h尿蛋白達(dá)到100 mg以上時(shí)，說(shuō)明腎病綜合征模型大鼠造模成功。在造模成功的47只大鼠中隨機(jī)選擇32只,并隨機(jī)分為模型組、沒(méi)食子酸低劑量組(50 mg/kg)、沒(méi)食子酸高劑量組(100 mg/kg)和醋酸潑尼松組(6 mg/kg),每組8只。其中沒(méi)食子酸低、高劑量組大鼠分別以50 mg/kg和100 mg/kg灌胃,1次/d;醋酸潑尼松組大鼠按照6 mg/kg灌胃醋酸潑尼松,1次/d;對(duì)照組和模型組同時(shí)以生理鹽水灌胃,1次/d。共持續(xù)干預(yù)8周,實(shí)驗(yàn)期間自由飲食飲水。

1.3.2 尿蛋白及血清生化指標(biāo)測(cè)定 尿蛋白指標(biāo)測(cè)定:將尿液置于離心機(jī)中,4 ℃下1 000 r/min離心10 min,取上清液,根據(jù)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定尿蛋白濃度,加入提前混合好的檢測(cè)試劑,37 ℃水浴孵育30 min取出,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值計(jì)算蛋白濃度,并綜合尿量計(jì)算24 h尿蛋白含量。血清生化指標(biāo)測(cè)定:最后一次給藥后24 h,處死各組大鼠,收集腹主動(dòng)脈血,靜置2 h后,在4 ℃離心機(jī)中以3 500 r/min離心10 min,取上清。根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血清白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)的水平。

1.3.3 組織處理染色 腎組織HE染色:取大鼠腎組織,一部分固定在10%中性福爾馬林液中,另一部分在液氮中快速冷凍后保存在-80 ℃。對(duì)腎組織進(jìn)行HE染色,將固定的腎組織經(jīng)梯度酒精脫水、常規(guī)石蠟包埋后,切成厚度為3 μm的薄片,蘇木精染色5 min,流水沖洗,伊紅染色液染色3 min,使用乙醇脫水后自然晾干,二甲苯透明10 min,中性樹(shù)膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。免疫組織化學(xué)染色:將固定好的腎組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,切片機(jī)切成3 μm 的石蠟組織切片。切片進(jìn)行脫蠟處理,滴加檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù),用3%H2O2室溫處理30 min。滴入山羊血清室溫封閉30 min,然后滴加一抗Nephrin(1∶500)并置于4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS沖洗,滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000),37 ℃孵育30 min。PBS沖洗后加入DAB溶液顯色,蘇木精溶液中復(fù)染。經(jīng)乙醇梯度脫水、透明后,自然晾干后,采用中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡采集圖像。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR TRIzol法提取腎組織總RNA,Nanodrop測(cè)定提取的RNA純度和濃度,按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá),以GAPDH作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min(1個(gè)循環(huán));95 ℃變性30 s(1個(gè)循環(huán)),55 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s(45個(gè)循環(huán))。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列由上海生工生物有限公司合成,具體序列:Sirtl上游引物:5′-TCATCTGTGAAAGTGATGACGA-3′,下游引物:5′-CTGCCACAGTGTCATATCATCA-3′;PPAR-γ上游引物:5′-TCTGTGGACCTCTCTGTGAG-3′,下游引物:5′-GCTCTTGTGACGGATGT-3′;GAPDH上游引物:5′-ACAGCAACAGGTGGTGGAC-3′,下游引物:5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′。

1.3.5 Western blot 將腎組織剪碎并加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解,在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min,收集上清液,BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定總蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品通過(guò)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,在5%脫脂奶粉中封閉2 h,滴加一抗兔抗PPARγ(1∶200)、兔抗Sirtl(1∶200)以及GAPDH(1∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日,TBST清洗3次,滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,通過(guò)滴加增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光,通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 在足細(xì)胞中添加含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 d換液1次,待細(xì)胞融合度至80%左右進(jìn)行消化傳代。將足細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml,取200 μl接種于96 孔板中,實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、高糖模型組和不同濃度沒(méi)食子酸(10、25、50 μmol/L)給藥組,對(duì)照組細(xì)胞采用11.1 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,模型組細(xì)胞采用30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,沒(méi)食子酸給藥組細(xì)胞分別采用含終濃度為10、25、50 μmol/L的沒(méi)食子酸培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 后,更換為30 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。

1.3.7 細(xì)胞活性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的足細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板上,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,按照“1.3.6”項(xiàng)進(jìn)行分組與處理。每孔滴加10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,采用酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度值。

1.3.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按照“1.3.6”處理各組足細(xì)胞,之后收集細(xì)胞,通過(guò)胰蛋白酶消化并離心,PBS洗滌后,制成細(xì)胞懸液,使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況,加入500 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞,在細(xì)胞懸浮液加入5 μl Annexin V-FITC,加入10 μl PI,混勻后室溫避光孵育15 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.9 免疫熒光染色 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期足細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度鋪于24孔板內(nèi)的無(wú)菌玻片上,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后,按照“1.3.6”項(xiàng)進(jìn)行分組處理后,PBS洗滌細(xì)胞,滴加10%中性甲醛溶液室溫固定20 min,自來(lái)水沖洗,滴加0.2% TritonX-100透膜處理15 min,然后加入 10%山羊血清，室溫封閉30 min,滴加一抗抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜,次日棄去一抗,滴加熒光二抗,暗室室溫孵育1 h后洗去未結(jié)合的二抗,滴加 DAPI 室溫染色 10 min,洗滌后封片,于熒光顯微鏡下觀察Nephrin和Podocin表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠尿蛋白含量明顯增高(P<0.05),血清中TC、TG、BUN水平增加(P<0.05),而ALB水平降低(P<0.05);與模型組比較,沒(méi)食子酸高、低劑量組和醋酸潑尼松組大鼠尿蛋白含量減少(P<0.05),TC、TG水平降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較(n=8)

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)分析 HE染色顯示,對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)病理改變;模型組大鼠可見(jiàn)腎小管結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)萎縮或擴(kuò)張,腎間質(zhì)增寬,且有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);經(jīng)低、高劑量的沒(méi)食子酸和醋酸潑尼松處理的大鼠,腎組織病變減輕,且高劑量沒(méi)食子酸和醋酸潑尼松處理的大鼠腎組織損傷程度較小,腎小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好,見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)腎組織病理變化(400×)

2.3 各組大鼠腎組織Nephrin表達(dá)檢測(cè) 結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠腎小球中Nephrin呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),模型組大鼠腎小球中Nephrin表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱,沒(méi)食子酸低、高劑量組和醋酸潑尼松組大鼠腎小球中Nephrin表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化染色檢測(cè)腎組織Nephrin蛋白表達(dá)(400×)

2.4 各組大鼠腎組織中SIRT1、PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)比較 結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組的腎組織中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,而PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平則顯著降低(P<0.05)。在沒(méi)食子酸高劑量組和醋酸潑尼松組大鼠腎組織中,SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組降低,PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組大鼠腎組織中SIRT1、PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)比較(n=8)

圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織SIRT1和PPAR-γ蛋白表達(dá)

2.5 各組足細(xì)胞存活率比較 結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,高糖模型組足細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)。沒(méi)食子酸各組細(xì)胞存活率均明顯高于高糖模型組細(xì)胞存活率(P<0.05),且隨著沒(méi)食子酸濃度的增加,存活率逐漸增加,見(jiàn)表3。

表3 各組足細(xì)胞存活率與凋亡率比較(n=6)

2.6 各組足細(xì)胞凋亡率比較 結(jié)果顯示,高糖模型組足細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組升高(P<0.05)。與高糖模型組比較,沒(méi)食子酸各組細(xì)胞凋亡率顯著下降,且隨著沒(méi)食子酸濃度的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸下降,見(jiàn)圖4、表3。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組足細(xì)胞凋亡

2.7 各組足細(xì)胞中Nephrin和Podocin表達(dá)檢測(cè) 結(jié)果顯示,觀察到對(duì)照組細(xì)胞中Nephrin和Podocin表達(dá)熒光較強(qiáng),高糖模型組Nephrin和Podocin表達(dá)熒光強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組,沒(méi)食子酸各組隨著藥物濃度升高,Nephrin和Podocin表達(dá)熒光強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng),見(jiàn)圖5。

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞中Nephrin和Podocin表達(dá)(100×)

3 討論

目前,NS主要的常規(guī)療法包括免疫抑制劑、抗炎藥和細(xì)胞毒性劑,其不良反應(yīng)大,如真菌感染和器官毒性,使NS的治療受到嚴(yán)重限制[8]。因此,鑒定用于治療NS的有效藥物或新療法對(duì)于該病的預(yù)防或治療至關(guān)重要。

采用阿霉素誘發(fā)的NS是目前常用的動(dòng)物造模方法,在本研究中,通過(guò)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠尿蛋白含量明顯增高,血清中TC、TG、BUN水平明顯增加,ALB水平降低,說(shuō)明大鼠腎功能受到損傷。以往研究表明,沒(méi)食子酸具有改善腎臟損傷的作用。Baradaran等[9]發(fā)現(xiàn),含有沒(méi)食子酸的蘆薈對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的雄性大鼠腎組織毒性具有保護(hù)作用;Nabavi等[10]研究表明,沒(méi)食子酸可保護(hù)大鼠腎臟免受氧化應(yīng)激損傷。在本研究中,沒(méi)食子酸干預(yù)的大鼠中尿蛋白量明顯減少,TC、TG水平也降低,HE染色顯示大鼠腎組織損傷程度減少,說(shuō)明沒(méi)食子酸具有改善NS大鼠腎功能的作用。

NS的特征是腎小球?yàn)V過(guò)功能障礙。足細(xì)胞位于腎小球基底膜的外表面,在維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障以及裂膜結(jié)構(gòu)的完整性中起著重要作用[11]。足細(xì)胞損傷或丟失是尿蛋白形成以及NS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。足細(xì)胞損傷機(jī)制復(fù)雜,主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、微循環(huán)障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[12]。本研究通過(guò)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷,觀察沒(méi)食子酸對(duì)足細(xì)胞存活與凋亡的影響。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)沒(méi)食子酸干預(yù)的足細(xì)胞在經(jīng)過(guò)高糖刺激后,細(xì)胞存活率升高而凋亡率下降。在與腎臟功能相關(guān)的分子介質(zhì)中,Nephrin和Podocin是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分,這2種基因表達(dá)改變與腎病密切相關(guān)。足蛋白包括腎素和Podocin在足細(xì)胞的裂隙膜中起主要作用,并且是維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障選擇性通透性的必需元素[13]。有研究表明,糖尿病腎病中Nephrin和Podocin基因表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致尿蛋白、腎小球硬化以及腎功能惡化[14]。本研究表明,Nephrin在腎病綜合征大鼠腎組織中表達(dá)減少,同時(shí),Nephrin和Podocin在高糖刺激的足細(xì)胞中表達(dá)受到抑制,而經(jīng)過(guò)沒(méi)食子酸干預(yù)后,大鼠腎組織中Nephrin表達(dá)增加,足細(xì)胞中Nephrin和Podocin的熒光強(qiáng)度增加。

PPARγ是核轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一,參與脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、脂肪細(xì)胞分化和免疫反應(yīng)等。研究表明,PPARγ在腎臟疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用,在糖尿病腎病中,PPARγ 激動(dòng)劑羅格列酮可顯著降低尿蛋白水平[15]。此外,激活PPARγ可減少NS大鼠腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性因子的表達(dá),并減輕足細(xì)胞損傷以起到保護(hù)腎臟的作用[16]。沉默信息調(diào)節(jié)因子 1(Sirt1)是第3類(lèi)組蛋白去乙?；窼irtuin 家族成員之一,通過(guò)去乙?；饔?，在氧化應(yīng)激、脂肪代謝、激素反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[17]。本研究結(jié)果顯示,在NS大鼠腎組織中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高而PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,經(jīng)沒(méi)食子酸干預(yù)后,SIRT1表達(dá)受到抑制,同時(shí)PPARγ表達(dá)激活。由此說(shuō)明,沒(méi)食子酸可能通過(guò)調(diào)控SIRT1/PPAR-γ通路發(fā)揮腎病綜合征大鼠腎功能的保護(hù)作用。

綜上所述,沒(méi)食子酸能夠顯著改善NS大鼠腎功能下降,減輕腎臟病理?yè)p害,并且減輕高糖刺激下的足細(xì)胞損傷,這可能是其治療腎病綜合征的機(jī)制之一。但沒(méi)食子酸對(duì)于足細(xì)胞損傷作用的關(guān)鍵信號(hào)通路目前并不清楚,以期進(jìn)行后續(xù)研究,以進(jìn)一步闡明沒(méi)食子酸治療NS的具體分子機(jī)制。