王恩龍，何黎黎，李 婧，2*

(1.西南民族大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué) 生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041)

新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所引起的一種急性感染性肺炎[1]，輕癥患者或初期患者主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，包括咳嗽、發(fā)熱、氣促以及呼吸困難等；后期或重癥患者可導(dǎo)致肺炎、急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[2]。然而，目前針對COVID-19尚無特效的化學(xué)藥物[3]，因此，從中藥中篩選針對抗COVID-19的中藥復(fù)方及活性化合物十分迫切。

化濕敗毒顆粒是國家藥品監(jiān)督管理局批復(fù)的首個(gè)治療新冠肺炎的中藥臨床批件，也是由此次疫病理論和臨床結(jié)合創(chuàng)新所得。本方由14味中藥組成，包括生麻黃、生石膏、杏仁、赤芍、葶藶子、法半夏、甘草、茯苓、藿香、草果、蒼術(shù)、厚樸、生黃芪、生大黃。中國醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所、中國中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究表明，化濕敗毒顆粒在動(dòng)物及臨床應(yīng)用中均顯示出良好效果。然而化濕敗毒顆粒藥味多、成分復(fù)雜，抗COVID-19作用關(guān)鍵活性成分及作用機(jī)制尚不清楚。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從整體上預(yù)測藥物作用靶點(diǎn)并分析作用機(jī)制的方法[4]，是目前生物信息學(xué)研究中藥的常用方法，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究化濕敗毒顆?？笴OVID-19作用機(jī)制與中藥多成分多靶點(diǎn)的研究思路相符。分子對接技術(shù)是目前一種廣泛應(yīng)用的能快速準(zhǔn)確地預(yù)測蛋白-配體復(fù)合物結(jié)合構(gòu)象和親和力并輔助篩選活性成分的重要研究技術(shù)[5]。近期，SARS-CoV-2的主要靶蛋白3CL水解酶蛋白(3CLpro)、宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)及RNA 依賴性RNA聚合酶(RdRp)相繼被解析，為分子對接篩選抗COVID-19活性中藥成分提供了基礎(chǔ)[6]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)，預(yù)測化濕敗毒顆粒治療COVID-19作用機(jī)理，篩選其潛在活性成分，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究開發(fā)以及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 化濕敗毒顆粒活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫挖掘化濕敗毒顆粒中14種藥材的化學(xué)成分。以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%以及藥物相似性(Drug-likeness，DL)≥0.18為參考評估篩選候選化合物，建立“化濕敗毒顆?；钚猿煞?jǐn)?shù)據(jù)庫”。通過TCMSP檢索以上活性成分的潛在作用靶點(diǎn)并整合，映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)統(tǒng)一為基因名，建立“化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫”。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/) 中檢索與病毒及肺炎相關(guān)的基因，將2種方法得到的靶蛋白整合并與“1.1”中得到的化合物靶點(diǎn)采用R語言取交集，作為化濕敗毒顆粒潛在的作用靶蛋白。

1.3 化濕敗毒顆粒成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

Cytoscape是一款能直觀分析藥物治療疾病的作用機(jī)制的可視化軟件[7]。將化濕敗毒顆粒的潛在活性成分及作用靶點(diǎn)通過Cytoscape(Version 3.7.1)建立“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)表示化合物及靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的互作用關(guān)系由邊(edge) 表示。節(jié)點(diǎn)的重要性可以通過自由度(Degree)及介數(shù)(Betweenness centrality)來評估。節(jié)點(diǎn)的Degree表示與節(jié)點(diǎn)連接的邊的數(shù)量，Degree越大的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。使用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

1.4 生物過程(GO)與通路分析(KEGG)

生物學(xué)信息注釋(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫可以進(jìn)行基因或蛋白顯著富集的生物學(xué)注釋。將化濕敗毒顆粒潛在的作用靶基因ID導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對化濕敗毒顆粒作用靶基因可能存在的生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)及分子功能(Molecular function，MF)進(jìn)行生物過程GO富集分析(P<0.05)以及KEGG通路富集分析(P<0.05)，根據(jù)P值大小繪制氣泡圖及柱狀圖。

1.5 分子對接分析關(guān)鍵活性成分

從RSCB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中下載SARS-CoV-2的3CLpro(PDB ID：6LU7)、ACE2(PDB ID：1R42)及RdRp(PDB ID：6M71)蛋白三維結(jié)構(gòu)用于分子對接研究。采用Auto Dock Tools 1.5.6 軟件刪除受體蛋白復(fù)合物中水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計(jì)算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件。從Pubchem下載“1.3”項(xiàng)中Degree較高的小分子化合物3D坐標(biāo)文件進(jìn)行預(yù)處理后保存為pdbqt格式，作為對接配體。分別以3CLpro、ACE2及RdRp蛋白為受體，將小分子化合物作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)或文獻(xiàn)報(bào)讀的活性位點(diǎn)確定分子對接的位置，根據(jù)每個(gè)受體蛋白活性口袋設(shè)置Gridbox坐標(biāo)及大小，采用Auto Dock Vina進(jìn)行分子對接，對對接結(jié)果進(jìn)行分析處理，篩選化濕敗毒顆粒潛在活性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 化濕敗毒顆?；钚猿煞趾Y選及靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到的化濕敗毒顆?；钚猿煞止?86個(gè)，其中生麻黃18個(gè)、杏仁12個(gè)、赤芍21個(gè)、葶藶子7個(gè)、甘草48個(gè)、法半夏10個(gè)、茯苓14個(gè)、草果2個(gè)、藿香11個(gè)、蒼術(shù)8個(gè)、生黃芪18個(gè)、厚樸2個(gè)、生大黃15個(gè)?；瘽駭《绢w粒中部分活性成分信息見表1。

表1 化濕敗毒顆粒中部分活性成分信息

2.2 化濕敗毒顆粒潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索“2.1”項(xiàng)中篩選得到的186種化合物的作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后與在OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到的與疾病相關(guān)的基因取交集，得到化濕敗毒顆粒潛在作用靶蛋白共237個(gè)。

2.3 化濕敗毒顆?！盎钚猿煞?作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將化濕敗毒顆粒活性成分及作用靶點(diǎn)的信息導(dǎo)入到Cytoscape軟件建立“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。由圖1可見，“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中有123個(gè)化合物及相應(yīng)的靶點(diǎn)237個(gè)，共包含360個(gè)節(jié)點(diǎn)及2 808條邊。拓?fù)浞治鲲@示化合物的平均Degree為7.8，說明每個(gè)活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，化濕敗毒顆粒作用具有多成分、多靶點(diǎn)特性。節(jié)點(diǎn)的Degree越大潛在活性越大，部分活性化合物Degree見表1，可見Degree較高化合物有Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Wogonin、7-O-methylisomucronulatol、Naringenin、Baicalein、Beta-sitosterol等(Degree≥26)，是化濕敗毒顆粒發(fā)揮作用重要的潛在活性化合物。PTGS2、PTGS1、NCOA2、ESR1、AR、PPARG、NOS2、PRSS1、SCN5A等靶基因的Degree均大于40，是化濕敗毒顆粒作用的重要潛在靶基因。

2.4 活性靶點(diǎn)生物學(xué)功能GO及KEGG通路富集分析

將“2.2”項(xiàng)中得到的化濕敗毒顆粒237個(gè)潛在靶基因ID導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對化濕敗毒顆粒作用靶點(diǎn)可能存在的生物過程BP、細(xì)胞組分CC及分子功能MF進(jìn)行生物過程GO富集分析(P<0.05)，分析得到GO條目共1 147個(gè)(P<0.05)，其中包括生物過程(BP)961個(gè)，分子功能(MF)110個(gè)，以及細(xì)胞組成(CC)76個(gè)，每種排名前10的條目見圖2。KEGG通路富集到170條信號通路(P<0.05)，排名前20的通路見圖3。由圖可見化濕敗毒顆粒作用涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF、C-type lectin receptor、HIF-1等信號通路。

注：紅色表示化濕敗毒顆?；钚猿煞?，藍(lán)色表示靶點(diǎn)蛋白，邊代表相互關(guān)系。

圖2 化濕敗毒顆粒潛在作用靶點(diǎn)GO基因功能分析

圖3 化濕敗毒顆粒潛在作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.5 化濕敗毒顆?？?019-nCoV活性成分分子對接

以Degree排名前15的重要活性成分(Degree≥22)作為配體，分別以SARS-CoV-2病毒 3CLpro、ACE2及RdRp為受體進(jìn)行分子對接。選取打分最高的構(gòu)象作為對接構(gòu)象，選取結(jié)合能較低且構(gòu)象較好的結(jié)果作為分子對接結(jié)果，選取作用明確的幾種3CLpro、ACE2及RdRp抑制劑作為對照?；瘽駭《绢w粒重要活性成分分子對接結(jié)果見表2，由表2可見，與3CLpro親和力較好的成分有Kaempferol、Baicalein等；與ACE2親和力較好的成分有Shinpterocarpin、Stigmasterol等；與RdRp親和力較好的成分有Beta-sitosterol、Shinpterocarpin等，這些成分可能是抗COVID-19的關(guān)鍵活性成分。幾種關(guān)鍵活性成分與靶蛋白分子對接圖見圖4，由圖4可見，Kaempferol與3CLpro蛋白在SER-144、LEU-141及GLN-189位形成氫鍵；Stigmasterol與ACE2蛋白在LYS-562位形成氫鍵；Shinpterocarpin與RdRp蛋白在THR-246位形成氫鍵。此外，活性成分與靶蛋白還形成了多個(gè)Pi-Cation、Pi-Alkyl等鍵。這些化學(xué)鍵使受體配體形成較穩(wěn)定的結(jié)合。

圖4 SARS-CoV-2三種靶蛋白與化濕敗毒顆粒中關(guān)鍵活性成分分子對接模式

表2 化濕敗毒顆粒重要化合物及臨床治療藥物與3種靶蛋白及ACE2 的結(jié)合親和力

3 討論

COVID-19屬于中醫(yī)“瘟疫”范疇，具有典型濕毒致病的發(fā)病特點(diǎn)，并與運(yùn)氣、氣候、地理及人群的易感性有關(guān)，涉及三焦、肺、胃、脾，在治療中應(yīng)采用群防群治與三因制宜相結(jié)合的措施[8]。其中醫(yī)病因病機(jī)是濕、毒、寒、熱、燥、虛、瘀，因此組方主要針對病毒的作用機(jī)理，化濕辟穢、宣肺通腑、活血解毒?；瘽駭《绢w粒由多個(gè)經(jīng)典名方化裁而來，傳承了中醫(yī)理論精華。本方選取了宣白承氣湯、麻杏石甘湯中的部分藥物，能宣肺清泄、疏散上焦；選取了藿香正氣散、達(dá)原飲中化濕和胃的藥物，可斡旋中焦；選取了葶藶大棗泄肺湯藥物、桃仁承氣湯中部分藥物，可通達(dá)下焦、活血解毒；選取玉屏風(fēng)散及黃芪赤風(fēng)湯部分藥物，可扶氣補(bǔ)正、調(diào)理氣血、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。本方的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，化濕敗毒顆粒對COVID-19具有良好的臨床療效和救治前景。

SARS-CoV-2需要 3CL 水解酶(3CLpro)來復(fù)制 RNA，是病毒的一個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)，若化合物與 3CLpro結(jié)合可大概率阻斷病毒復(fù)制，抑制病毒多蛋白裂解并防止傳播，為抗病毒藥物研發(fā)指明方向，因此本研究在微觀層面運(yùn)用分子對接技術(shù)，挖掘化濕敗毒顆粒抗新型冠狀病毒的特異性及可能性。與3CLpro進(jìn)行對接，結(jié)果提示Kaempferol、Baicalein等成分與3CLpro具有較好的親和力，可作為SARS-CoV-2 3CLpro潛在抑制劑。

已有研究表明，新型冠狀病毒感染人體的關(guān)鍵在于SARS-CoV-2表面的S蛋白(刺突糖蛋白，Spike glyco-protein，簡稱S蛋白) 識(shí)別人類宿主的ACE2蛋白從而進(jìn)入細(xì)胞，尤其是S蛋白結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)(Receptor binding domain，RBD)直接參與宿主受體的識(shí)別與人體ACE2蛋白的結(jié)合，即病毒通過其表面S蛋白與ACE2結(jié)合從而侵入人體[9]，目前，S蛋白和 ACE2蛋白已被確定為潛在的臨床試驗(yàn)疫苗和治療靶點(diǎn)，其蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)成功解析，這就為通過電腦虛擬篩選針對這2種蛋白的抗病毒藥物提供了可能。清肺達(dá)原顆粒中有52基因?yàn)锳CE2的共表達(dá)基因。本研究選取化濕敗毒顆粒中的化合物與SARS-CoV-2-S-RBD-ACE2進(jìn)行分子對接，研究發(fā)現(xiàn)Stigmasterol、Shinpterocarpin等成分與ACE2具有較好的親和力，可作為SARS-CoV-2 ACE2潛在抑制劑。

作為RNA 病毒，病毒自身編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)對病毒的RNA 復(fù)制起關(guān)鍵作用，RdRp 抑制劑可作為抗RNA 病毒的廣譜抗病毒藥物。RdRp蛋白結(jié)構(gòu)中有一個(gè)大而深的凹槽結(jié)構(gòu)區(qū)作為RNA合成的活性中心。以RdRp作為靶點(diǎn)的藥物也是目前研發(fā)的熱點(diǎn)，Ribavirin及Remdesivir是目前正處于臨床研究的COVID-19病毒RdRp抑制劑。近期“清華大學(xué)-上海科技大學(xué)抗新冠病毒聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)”在全世界率先成功解析新型冠狀病毒“RdRp-nsp7-nsp8復(fù)合物”近原子分辨率的三維空間結(jié)構(gòu)，為本研究分子對接尋找化濕敗毒顆粒中RdRp抑制成分提供了蛋白基礎(chǔ)。分子對接結(jié)果提示Beta-sitosterol、Shinp-terocarpin等成分與RdRp具有較好的親和力，可作為SARS-CoV-2 RdRp潛在抑制劑。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對化濕敗毒顆粒抗COVID-19的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，并對化濕敗毒顆?？笴OVID-19具有較高度數(shù)的關(guān)鍵化學(xué)成分進(jìn)行了篩選，并進(jìn)一步采用分子對接的方式，以目前作用明確且已解析可得的3種蛋白3CLpro、ACE2及RdRp蛋白為靶蛋白，對化濕敗毒顆粒中Degree較高的重要活性成分進(jìn)行了分子對接，篩選出關(guān)鍵活性成分。對接結(jié)果顯示，化濕敗毒顆粒中Degree較高的Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Wogonin、7-O-methylisomucronulatol、Naringenin、Baicalein、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Formononetin等成分與靶蛋白均有一定親和力。Quercetin(槲皮素)是一種天然黃酮類化合物，可激活或抑制許多蛋白質(zhì)的活性，槲皮素可抑制流感病毒及HCV病毒[10]。Kaempferol(山奈酚)屬于黃酮類化合物，山奈酚可以抑制流感、HIV等病毒[11-12]。Luteolin(木犀草素)是一種天然黃酮類化合物，可以通過干擾外殼蛋白I復(fù)合物的表達(dá)在體外抑制甲型流感病毒[13]，還可以通過抑制前蛋白轉(zhuǎn)化酶抑制登革病毒復(fù)制[14]。Baicalein(黃芩素)是黃芩中含量較高的黃酮類化合物，黃芩素對流感病毒有抑制作用[16]，還具有抗登革病毒活性[15]。

化濕敗毒顆粒作為國家藥品監(jiān)督管理局首個(gè)批準(zhǔn)用于臨床的中藥復(fù)方，其作用機(jī)制和活性成分尚無研究，因此我們從兩方面探討化濕敗毒顆粒對抗COVID-19疾病的潛在機(jī)制及活性成分。一方面運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確活性成分及其靶蛋白，構(gòu)建化濕敗毒方的“成分-靶點(diǎn)-通路”多層次互作網(wǎng)絡(luò)；另一方面通過分子對接技術(shù)分析化濕敗毒方的活性化合物抗SARS-CoV-2的特異性及可能性，為后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)假設(shè)及理論依據(jù)，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥抗擊疫情的防治效果。