崔守瑜，戴奕杰

（1.釣魚臺賓館管理局，北京 100830；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州貴陽 550016）

白酒是中國的傳統(tǒng)行業(yè)，是世界六大蒸餾酒之一。在不斷發(fā)展過程中，根據(jù)其制作工藝及風味的不同，可分為清香、濃香、醬香等基本香型。其中，醬香型白酒以其“醬香突出、優(yōu)雅細膩、柔綿醇厚、回味悠長”的獨特風味，受到廣大消費者的青睞。醬香型白酒的發(fā)酵過程獨特而復雜，包括大曲制作、堆積發(fā)酵及窖池輪次發(fā)酵等[1]，高溫堆積、高溫蒸餾、多輪次發(fā)酵、生產(chǎn)周期長、貯存時間長等特點使得醬香型白酒區(qū)別于其他香型酒[2]。醬香型白酒在生產(chǎn)過程中，多階段多輪次的微生物發(fā)酵是質(zhì)控的關(guān)鍵步驟，因此每個發(fā)酵階段酒醅中的微生物動態(tài)變化，對后期白酒產(chǎn)量及風味均具有重大貢獻。尤其堆積發(fā)酵是大曲制作和酒窖發(fā)酵之間的橋梁[3]，開放式的地面堆積發(fā)酵能使環(huán)境中的微生物參與到整個發(fā)酵過程，調(diào)整酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)，以促進酒醅中的物質(zhì)充分分解轉(zhuǎn)化，還為美拉德反應提供了前提條件。

最近的研究主要集中在酒曲的質(zhì)控提升、窖泥中微生物群落的特征及酒的風味成分[4-5]，也有研究根據(jù)不同香型酒，分別研究清香型、濃香型、醬香型酒發(fā)酵時間的不同，比較菌群多樣性與風味的相關(guān)性[6-7]。杜艾明[8]調(diào)查了清香型白酒釀造核心功能微生物，主要是乳酸菌、醋酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌及少數(shù)霉菌，這些菌群的更新變化與酒中的風味成分具有直接關(guān)系。高江婧[9]研究了濃香型白酒酒醅中風味物質(zhì)與微生物群結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)窖池底泥為酒醅提供了梭菌科和瘤胃菌科等厭氧微生物，這些微生物促進發(fā)酵后期己酸、丁酸、乙酸的合成，對濃香型白酒的風味具有重大貢獻。高溫堆積發(fā)酵作為醬香型白酒的特征工藝，是大曲釀造和窖池發(fā)酵的緊密連接，在堆積發(fā)酵過程中物料和微生物發(fā)生的變化規(guī)律也是眾多學者所一直關(guān)注的熱點問題。

本研究以醬香型白酒為研究對象，研究了在下沙、糙沙輪次堆積發(fā)酵中，酒醅堆積溫度及pH 值與微生物群動態(tài)變化的相關(guān)性，為揭示醬香型白酒生產(chǎn)微生物變化及風味形成機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：下沙、糙沙及7 個輪次起窖、下窖過程中的酒醅；化學試劑及培養(yǎng)基均為國藥分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

選取從下沙階段到7 輪次高溫堆積樣品，及酒醅下窖于窖池發(fā)酵的樣品。根據(jù)等距采樣法，分別在酒醅上、中、下層等距采集3 個位點的樣本。樣本采集后混合均勻，并分裝于無菌袋封裝標記，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 微生物的分離及計數(shù)

根據(jù)國標GB 4789.2—2016 方法處理樣品。取25 g 不同加工階段的酒醅樣品，于裝有225 mL 無菌生理鹽水（含6 粒玻璃珠）的錐形瓶中，置于搖床中振蕩5 min，使樣品液充分均勻。吸取1 mL樣品液于9 mL 無菌生理鹽水中，混合均勻后，重復這一步，進行梯度稀釋，并吸取100 μL 2～3 個適宜稀釋梯度的樣品液于不同微生物培養(yǎng)基中，對霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌及菌落總數(shù)進行計數(shù)。

1.2.3 pH值的測定

根據(jù)文獻方法[10]，取5 g 酒醅，加入45 mL 蒸餾水，置于漩渦振蕩器上混合均勻。靜置5 min，取上清液測定pH值。

1.2.4 溫度的測定

采用探針溫度計對不同發(fā)酵時期的酒醅堆進行溫度測量，待溫度計數(shù)值穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 下沙、糙沙輪次堆積發(fā)酵酒醅的微生物變化

通過倍比稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法發(fā)現(xiàn)，酒醅在不同發(fā)酵階段微生物菌群呈動態(tài)變化。由表1 可知，發(fā)酵初期（下沙堆積）菌群得以快速增殖，菌落總數(shù)高達9.7×108CFU/g，主要為酵母菌、乳酸菌，但芽孢桿菌和霉菌仍占一定比例。在糙沙起窖階段，可能是新物料加入，使得原有的微生物菌落數(shù)相對減少，但隨著堆積發(fā)酵，微生物又利用新的物料進行生長代謝，因此各菌群在堆積過程中均有增殖現(xiàn)象。

表1 不同發(fā)酵時期酒醅中微生物變化 （CFU/g）

窖池發(fā)酵可以再次富集培養(yǎng)環(huán)境中的微生物，在一輪次至三輪次的窖池發(fā)酵中，主要功能優(yōu)勢菌是酵母菌屬，數(shù)量可達到106～107CFU/g，其次是霉菌屬，數(shù)量在105～107CFU/g。酵母菌是參與發(fā)酵產(chǎn)酒產(chǎn)香的重要微生物，但酵母菌在高溫環(huán)境下無法生存。酵母菌的帶入可能是因為開放式的生產(chǎn)環(huán)境使得環(huán)境中的酵母菌散落在酒醅表面并在堆積發(fā)酵中生長繁殖，之前也有研究證明，酵母菌在酒醅中的豐度是上層高于中、下層[11]。因此在一輪次起窖階段，酵母菌菌落數(shù)遠低于堆積發(fā)酵時期。但在下窖期，酵母菌有增殖趨勢，結(jié)合溫度檢測結(jié)果，可能是第一次下窖，窖池溫度較低，適合于酵母菌的大量繁殖。但隨著酒醅在窖池中繼續(xù)發(fā)酵，微生物繁殖釋放出大量熱量，酵母菌無法存活在高溫環(huán)境中，酵母菌在整個釀造過程中活菌數(shù)呈現(xiàn)出波浪型的變化規(guī)律。

霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，有助于分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，有促進風味物質(zhì)形成的作用[12]。由表1 可知，霉菌在堆積階段是呈上升趨勢的，最大值可達1.2×107CFU/g，但下窖池發(fā)酵后，可能是因為高溫、水分含量少、缺氧導致霉菌最終下降至400 CFU/g。霉菌與酵母菌的變化規(guī)律類似，也是呈動態(tài)波動的。據(jù)報道，霉菌能產(chǎn)生豐富的酯化酶系，所產(chǎn)生的酶能將酸與醇縮合成酯，同時，多種霉菌共同發(fā)酵，釋放出含硫香味物質(zhì)的前體，轉(zhuǎn)化為含硫的雜環(huán)香味物質(zhì)，形成特有的醬香味[13]。王曉丹[14]從醬香型大曲中分離得到1 株散囊菌——阿姆斯特丹散囊菌，該菌能產(chǎn)生L-芳樟醇、2-庚酮等花果香味，這對醬香型白酒的風味具有一定貢獻。

細菌是廣泛存在于整個制作工藝中的，因此通過高溫發(fā)酵后所生存下來的細菌主要是嗜熱菌，以芽孢桿菌屬、乳酸菌屬為主。在下沙堆積階段，酒醅中乳酸菌含量很高，高達108數(shù)量級，而在發(fā)酵中期，回落到104數(shù)量級，后期可能窖泥中的厭氧菌摻入酒醅中迅速增殖，而在氧氣充分時，部分死亡，發(fā)酵末期有回升的現(xiàn)象。芽孢桿菌作為高溫大曲中重要功能菌組成成分，在整個發(fā)酵期間較穩(wěn)定，堆積初期最高可達5.2×106CFU/g，但在整個發(fā)酵期基本保持在104CFU/g的豐度，發(fā)酵末期又回升到106CFU/g，符合菌群動態(tài)變化規(guī)律。

2.2 下沙、糙沙輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅的溫度變化情況（圖1）

圖1 不同發(fā)酵時期，酒醅溫度的變化

在堆積發(fā)酵過程中，復雜的微生物群會分解淀粉、蛋白質(zhì)等釋放出大量熱量，探究堆積發(fā)酵過程的溫度變化有助于間接了解微生物的代謝情況。下沙、糙沙堆積從起堆到堆積完成大概需要3 d，因此我們檢測了堆積24 h、48 h、72 h酒醅溫度變化情況。由圖1 可看出，不管是下沙還是糙沙堆積階段，酒醅溫度均隨發(fā)酵時間的延長而升高，且在24～48 h 溫度上升很快，在72 h 時達到最高，溫度達41～51.8 ℃。而酒醅在一輪次下窖后，前3 天的溫度變化情況較緩慢，但仍呈上升趨勢。二輪次下窖后的酒醅溫度變化同樣較緩慢，屬于延遲期。在經(jīng)過前期幾輪反復的起窖發(fā)酵和下窖發(fā)酵后，從三輪次下窖開始，酒醅在酒窖中發(fā)酵溫度上升很快，且溫度高達60 ℃。各階段的發(fā)酵溫度均與發(fā)酵時間直接相關(guān)，隨發(fā)酵時間的延長而溫度上升。

綜合以上現(xiàn)象分析，各發(fā)酵階段酒醅變化隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)直線型變化，且整體發(fā)酵過程成“V”型曲線，這可能與不同時期其優(yōu)勢功能微生物菌屬的生長代謝有關(guān)聯(lián)，而在后期發(fā)酵更利于嗜熱性微生物生長代謝釋放出大量的熱量。

2.3 下沙、糙沙輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅的pH 值變化情況（圖2）

圖2 不同發(fā)酵時期，酒醅pH值的變化

由圖2 所知，在發(fā)酵初期，酒醅的pH 值由4.4下降到3.7，這可能是酵母菌的迅速繁殖，產(chǎn)生了大量的CO2，使得酒醅pH 值迅速下降。然而在堆積發(fā)酵中，由于霉菌、酵母菌、乳酸菌及芽孢桿菌均在大量繁殖，代謝產(chǎn)物中和了氫離子的濃度，使得pH值又回調(diào)到了4.4 左右。而在下窖到窖池發(fā)酵階段，酒醅pH 值變化較小，基本穩(wěn)定在3.5 左右，說明pH 3.5 左右時對產(chǎn)酸菌的生長有抑制作用，也可能是由于酒醅中的氧氣被消耗掉，進入?yún)捬醢l(fā)酵，使得酵母從有氧代謝轉(zhuǎn)化為無氧代謝，產(chǎn)生大量酒精。環(huán)境中的厭氧菌和酒醅中的兼性厭氧菌得以增殖，代謝產(chǎn)生有機酸，大部分有機酸為弱酸，對pH值影響不顯著。

3 小結(jié)

通過醬香型白酒酒醅的不同生產(chǎn)加工階段，研究了酒醅中主要的優(yōu)勢微生物菌群及溫度、pH 值的變化，發(fā)現(xiàn)在整個發(fā)酵生產(chǎn)過程中，菌落總數(shù)呈現(xiàn)出一個動態(tài)的“V”型變化規(guī)律。前期主要以酵母菌屬、乳酸菌屬發(fā)酵產(chǎn)熱產(chǎn)酸，中期芽孢桿菌生長較穩(wěn)定，由于窖池厭氧發(fā)酵，酒醅堆積溶氧量不夠，升溫較緩慢。后期因釀造原料被充分分解，形成了較大的細孔，且pH 值下降到了3.5 抑制了霉菌及酵母菌的生長，但厭氧性芽孢桿菌得到大量繁殖，釋放出大量熱量。每個發(fā)酵階段的優(yōu)勢功能菌根據(jù)發(fā)酵環(huán)境及條件的變化進行更替，以充分利用釀造原料中的營養(yǎng)物質(zhì)進行代謝分解，釋放出各種生物酶，代謝產(chǎn)生具有香味或風味的代謝產(chǎn)物，為提升酒產(chǎn)量及酒質(zhì)做出了一定貢獻。