金鳳羽 阮祥燕 杜 娟 程姣姣 李揚(yáng)璐 王虎生 谷牧青 鞠 蕊 楊 瑜 王月姣 許 新

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026)

卵巢是女性重要的生殖內(nèi)分泌器官，對(duì)于女性生殖能力和正常內(nèi)分泌環(huán)境的維持具有重要意義，一旦受損或功能喪失，將嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量和身心健康。年輕女性癌癥患者在治療原發(fā)疾病的過(guò)程中，卵巢功能往往遭到嚴(yán)重的不可逆性損傷，導(dǎo)致患者卵巢功能早衰，失去生育能力。因此如何保護(hù)這些患者的生殖力在世界范圍內(nèi)備受學(xué)者關(guān)注。

卵巢組織凍存技術(shù)是保護(hù)女性生殖力的重要方法之一，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①在一片組織中保存數(shù)百個(gè)甚至上千個(gè)不同成熟度的卵泡；②無(wú)須藥物超促排卵，不會(huì)延誤癌癥的最佳治療時(shí)間；③還能在一定程度上恢復(fù)卵巢內(nèi)分泌功能[1-2]；④是青春期前女性或需要立即治療的患者的唯一選擇[3-4]。卵巢組織凍存技術(shù)在歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，然而現(xiàn)階段該技術(shù)在北京及周邊地區(qū)僅首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院已經(jīng)將其應(yīng)用至臨床，并成功對(duì)10例患者進(jìn)行了卵巢組織凍存再移植[5]，其中一位患者實(shí)現(xiàn)了自然妊娠[6]，標(biāo)志著該技術(shù)在我國(guó)臨床應(yīng)用過(guò)程中的零突破。然而仍然有相當(dāng)大一部分患者及醫(yī)務(wù)工作者對(duì)卵巢組織凍存這項(xiàng)技術(shù)并不了解，存在著諸多誤解，導(dǎo)致大量需要卵巢組織凍存以保護(hù)生殖力的女性患者因?qū)υ摷夹g(shù)不了解而錯(cuò)失良機(jī)。全面評(píng)估現(xiàn)階段首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院卵巢組織凍存技術(shù)的臨床應(yīng)用情況，對(duì)于今后該技術(shù)在全國(guó)的大面積推廣，使得更多患者能夠有機(jī)會(huì)接觸、了解并最終從中獲益有著重要的參考意義。因此本研究首先對(duì)在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院卵巢組織庫(kù)進(jìn)行凍存患者的疾病分布特點(diǎn)以及人口學(xué)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，初步評(píng)估該技術(shù)的總體應(yīng)用情況。然后對(duì)比部分患者新鮮組和凍存/復(fù)蘇組卵泡活性計(jì)數(shù)的差異，全面驗(yàn)證該技術(shù)的有效性及穩(wěn)定性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

將2016年9月至2021年4月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院人卵巢組織凍存庫(kù)進(jìn)行卵巢組織凍存以保護(hù)生殖力的患者共217例作為研究對(duì)象，收集其年齡、患病類型、地區(qū)、凍存前是否接受了放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)及化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)等情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。募集其中的46例患者并經(jīng)過(guò)充分知情同意后，在凍存前取其卵巢組織的一部分進(jìn)行相關(guān)研究。每位患者取4個(gè)卵巢皮質(zhì)標(biāo)本，采用數(shù)字表法隨機(jī)選取其中2個(gè)新鮮標(biāo)本到新鮮組進(jìn)行卵泡活性計(jì)數(shù)，剩余的2個(gè)標(biāo)本分到程序化凍存復(fù)蘇組進(jìn)行程序化冷凍/復(fù)蘇后再進(jìn)行卵泡活性計(jì)數(shù)。所有患者進(jìn)行卵巢組織凍存前卵巢組織常規(guī)送病理，除外卵巢組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

1.2 卵巢標(biāo)本制作

卵巢組織獲取后按照標(biāo)準(zhǔn)化流程轉(zhuǎn)運(yùn)至人卵巢組織凍存庫(kù)，由專業(yè)技術(shù)人員在無(wú)菌操作臺(tái)上，4 ℃環(huán)境下使用無(wú)菌刀片去除卵巢髓質(zhì)，僅保留卵巢皮質(zhì)部分。同意進(jìn)行卵泡活性對(duì)比研究的患者使用直徑為 2 mm 的圓形Punch取材器另取其卵巢組織皮質(zhì)標(biāo)本，每人4個(gè)。

1.3 程序化凍存/復(fù)蘇

本研究采用程序化凍存，具體冷凍方案參照2007年Isachenko V發(fā)表的相關(guān)論文[7]?；颊叩?個(gè)卵巢組織標(biāo)本在4 ℃凍存液中平衡15 min后轉(zhuǎn)移至含有1.8 mL凍存液的無(wú)菌凍存管內(nèi)進(jìn)行程序化冷凍。降溫速度如下：由室溫按照2 ℃/min的速度降至-6 ℃，在-6 ℃時(shí)進(jìn)行人工誘導(dǎo)冰晶形成。然后按照0.5 ℃/min的速度繼續(xù)降溫至溫度達(dá)到-40 ℃，最后按照50 ℃/min的速度迅速降至-140 ℃。冷凍完成后將無(wú)菌凍存管轉(zhuǎn)移至-196 ℃液氮儲(chǔ)罐中儲(chǔ)存，7 d以后進(jìn)行復(fù)蘇。

復(fù)蘇采用慢速?gòu)?fù)溫法。凍存管從液氮罐取出后在37 ℃水浴箱中快速?gòu)?fù)溫后至0 ℃左右，待凍存液大部分融化后將卵巢組織標(biāo)本取出，置于含有不同濃度梯度復(fù)蘇液的6孔板中逐步繼續(xù)復(fù)溫、洗滌。前45 min，每隔15 min更換到6孔板內(nèi)下一個(gè)孔，每孔所含復(fù)蘇液的濃度不同。后20 min每隔10 min更換一孔。整個(gè)復(fù)蘇過(guò)程共更換5次孔位。

1.4 卵泡活性計(jì)數(shù)

根據(jù)鈣黃綠素AM(Calcein AM)只能在活細(xì)胞中才能被代謝轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生熒光綠色這一特點(diǎn)，本研究使用Calcein AM對(duì)每位患者的2個(gè)新鮮卵巢組織標(biāo)本和2個(gè)凍存/復(fù)蘇后卵巢組織標(biāo)本分別進(jìn)行染色，再在495 nm熒光顯微鏡下進(jìn)行卵泡活性計(jì)數(shù)。

1.5 試劑配制

凍存液：每100 mL凍存液內(nèi)包含人血清白蛋白(IrvineScience公司，美國(guó))5 mg，10%(體積分?jǐn)?shù))CryoSure-DMSO(WAK-Chemie Medical GmbH)5 mL和Leibovitz’s L-15(Gibco公司，美國(guó))90 mL。

復(fù)蘇液：每100 mL復(fù)蘇液內(nèi)含90 mL DPBS(Gibco公司,美國(guó))和10 mL人血清白蛋白(IrvineScience公司，美國(guó))。前3孔的復(fù)蘇液內(nèi)蔗糖含量分別為0.75 mol/L、0.45 mol/L、0.125 mol/L，后兩孔復(fù)蘇液內(nèi)無(wú)蔗糖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織凍存患者的年齡、地區(qū)分布及凍存前放療及化療比例

217例卵巢組織冷凍保存患者中年齡最小者1歲，最大者47歲，中位年齡32歲，P25和P75分別為27歲和35歲。在這些進(jìn)行了卵巢組織凍存以保護(hù)生殖力的女性患者中以31～35歲為主，占總凍存人數(shù)的36.4%；小于25歲的人群所占比例最小，占總?cè)藬?shù)的19.4%；26～30歲之間及36歲以上的人群占比分別為25.3%和18.9%。

卵巢組織凍存的患者以北京地區(qū)為主，共116例，占總?cè)藬?shù)的53.5%，北京周邊及外省患者共101例，占總?cè)藬?shù)的46.5%。凍存前接受過(guò)影響性腺功能的放療和/或化療的患者共計(jì)37例，占總?cè)藬?shù)的17.1%，未接受過(guò)相關(guān)治療的患者共計(jì)180例，占總?cè)藬?shù)的82.9%。

2.2 卵巢組織凍存患者疾病種類及占比

217例進(jìn)行卵巢組織凍存的患者中宮頸癌是主要患病類型，共計(jì)107例(49.31%)，其次是子宮內(nèi)膜癌27例(12.44%)。按照所占比例下降方式排列依次為乳腺癌23例(10.60%,)，白血病12例(5.53%,)，卵巢腫瘤10例(4.61%)，骨髓增生異常綜合征4例(1.84%)，霍奇金淋巴瘤4例(1.84%)，直腸癌3例(1.38%,)，膀胱癌2例(0.92%)，再生障礙性貧血2例(0.92%)，B細(xì)胞淋巴瘤2例(0.92%)，陰道癌2例(0.92%)，其他疾病包括脂肪肉瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、范科尼貧血、血小板功能異常、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良等共計(jì)19例(8.76%)(圖1)。

圖1 卵巢組織凍存患者疾病類型及所占比例Fig.1 The disease type and proportion of the patients with ovarian tissue cryopreservation MDS: myelodysplastic syndromes.

2.3 程序化凍存/復(fù)蘇卵泡活性計(jì)數(shù)

46例同意進(jìn)行卵巢組織活性計(jì)數(shù)對(duì)比研究的患者中年齡最小者16歲，最大者41歲，平均年齡(32.2±6.9)歲。新鮮卵巢組組的卵泡活性計(jì)數(shù)為59.04±78.067，凍存/復(fù)蘇組卵泡活性計(jì)數(shù)為50.59±62.942，兩組卵泡活性計(jì)數(shù)比較，凍存復(fù)蘇組卵泡計(jì)數(shù)雖然在一定程度上有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見(jiàn)表1。兩組卵泡活性檢測(cè)典型圖片見(jiàn)圖2。

圖2 新鮮卵巢組織與復(fù)蘇后卵巢組織卵泡活性檢測(cè)典型圖片F(xiàn)ig.2 Typical pictures of follicular activity in the fresh and frozen-thawed ovarian tissue

表1 新鮮卵巢組織組和凍存/復(fù)蘇組卵泡活性計(jì)數(shù)比較

3 討論

卵巢組織凍存最佳適應(yīng)證之一是乳腺癌。這是因?yàn)閹缀踉谒腥橄侔┰\療指南所推薦的輔助化療方案中幾乎都包含了環(huán)磷酰胺[8]，而環(huán)磷酰胺是一種生殖毒性最強(qiáng)的烷化劑之一，導(dǎo)致年輕女性術(shù)后的實(shí)際妊娠率不足5%[9]。因此，在歐洲最大的生殖力保護(hù)中心—FertiPROTEKT網(wǎng)絡(luò)中心(包括德國(guó)、奧地利和瑞士等在內(nèi)的85個(gè)中心)進(jìn)行生殖力保護(hù)的4 060名婦女中，乳腺癌癥患者高達(dá)41%[10]。然而，本研究卻發(fā)現(xiàn)在本院進(jìn)行卵巢組織凍存的患者就疾病類型而言，以宮頸癌為主，幾乎占到所有凍存人數(shù)的一半，其次是子宮內(nèi)膜癌，乳腺癌僅排第三。這一現(xiàn)象一方面與中國(guó)乳腺癌發(fā)病率低于歐美國(guó)家有關(guān)。另一方面與卵巢組織凍存技術(shù)在中國(guó)開(kāi)展?fàn)顩r及認(rèn)知程度有關(guān)。在中國(guó)能夠進(jìn)行專業(yè)地卵巢組織凍存生殖力保護(hù)的醫(yī)院寥寥無(wú)幾，而北京婦產(chǎn)醫(yī)院已經(jīng)成功地完成了中國(guó)首例凍存卵巢組織再移植手術(shù)，在接受卵巢組織再移植手術(shù)的10例患者中更是有一位已經(jīng)自然妊娠[5-6,11-13]，這就決定了卵巢組織凍存技術(shù)的推廣在某種程度上在北京及其周邊地區(qū)是以北京婦產(chǎn)醫(yī)院為中心向外擴(kuò)展。在現(xiàn)有的推廣模式下，了解和接受卵巢組織凍存技術(shù)相關(guān)信息最快、最完整的人群是婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)部婦科腫瘤科的醫(yī)護(hù)人員及需要進(jìn)行生育力保護(hù)的婦科腫瘤患者。這部分患者以宮頸癌為主，導(dǎo)致了現(xiàn)階段進(jìn)行卵巢組織凍存的患者中宮頸癌占據(jù)了很大比例。宮頸癌患者雖然因?yàn)樵l(fā)疾病需要全子宮切除或多次放療，失去受孕的機(jī)會(huì)，但在原發(fā)病緩解之后進(jìn)行卵巢組織再移植可以幫助患者恢復(fù)內(nèi)分泌的功能，大大提高患者的生命質(zhì)量，減少相關(guān)激素藥物的使用，因此宮頸癌也是進(jìn)行卵巢組織凍存的適應(yīng)證之一。

在中國(guó),人們對(duì)卵巢組織凍存技術(shù)普遍認(rèn)知有限，具體表現(xiàn)在許多臨床醫(yī)生包括乳腺科醫(yī)生本身認(rèn)為保留生育能力與保命是相抵觸的，抑或是生育能力的保留是可有可無(wú)的事情，持有無(wú)所謂的態(tài)度。部分凍存患者在進(jìn)行卵巢組織凍存前已經(jīng)接受了多次的放化療，卵巢功能已經(jīng)遭受一定程度的破壞，導(dǎo)致了大量年輕甚至于年幼需要生殖力保護(hù)的女性癌癥患者失去生殖力保護(hù)的良機(jī)，或是保護(hù)效果欠佳，失去做母親或者保留內(nèi)分泌功能的最后機(jī)會(huì)。鑒于此種情況，醫(yī)務(wù)人員可以借助宣傳冊(cè)、網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)、科普講座等方式，在全國(guó)范圍內(nèi)大力普及人卵巢組織凍存技術(shù)相關(guān)知識(shí)，幫助醫(yī)務(wù)工作者意識(shí)到生殖力保護(hù)的必要性和可行性，讓需要進(jìn)行生殖力保護(hù)的年輕女性患者了解到還有一種新的選擇和希望。

卵巢組織凍存是一種運(yùn)用低溫生物學(xué)原理從而達(dá)到冷凍保存卵巢組織的方法，在凍存過(guò)程中不可避免出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)冰晶形成所帶來(lái)的損傷和高溶液濃度導(dǎo)致的溶液損傷。目前，國(guó)際上大部分報(bào)道經(jīng)過(guò)程序化冷凍/復(fù)蘇后，卵巢組織內(nèi)活性卵泡的存活率為70%～80%[13-14]，本研究對(duì)比了新鮮卵巢組織組和程序化冷凍/復(fù)蘇后組卵巢組織內(nèi)活性卵泡計(jì)數(shù)的變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再次證實(shí)了卵巢組織凍存技術(shù)能夠有效地保存卵巢組織內(nèi)的卵泡，與國(guó)際水平相似，能夠?yàn)榛颊呱沉Φ挠行П４婕叭蘸舐殉步M織再移植后實(shí)現(xiàn)內(nèi)分泌功能的恢復(fù)甚至妊娠意愿提供了必要的基礎(chǔ)。

結(jié)論：北京婦產(chǎn)醫(yī)院進(jìn)行卵巢組織凍存人群的疾病類型主要是宮頸癌。卵巢組織凍存技術(shù)能夠有效地保存患者的生育力。