金鳳羽 阮祥燕 杜 娟 程姣姣 李揚璐 王虎生 谷牧青 鞠 蕊 楊 瑜 王月姣 許 新

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026)

卵巢是女性重要的生殖內(nèi)分泌器官，對于女性生殖能力和正常內(nèi)分泌環(huán)境的維持具有重要意義，一旦受損或功能喪失，將嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量和身心健康。年輕女性癌癥患者在治療原發(fā)疾病的過程中，卵巢功能往往遭到嚴(yán)重的不可逆性損傷，導(dǎo)致患者卵巢功能早衰，失去生育能力。因此如何保護這些患者的生殖力在世界范圍內(nèi)備受學(xué)者關(guān)注。

卵巢組織凍存技術(shù)是保護女性生殖力的重要方法之一，具有獨特的優(yōu)勢：①在一片組織中保存數(shù)百個甚至上千個不同成熟度的卵泡；②無須藥物超促排卵，不會延誤癌癥的最佳治療時間；③還能在一定程度上恢復(fù)卵巢內(nèi)分泌功能[1-2]；④是青春期前女性或需要立即治療的患者的唯一選擇[3-4]。卵巢組織凍存技術(shù)在歐洲發(fā)達國家和地區(qū)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，然而現(xiàn)階段該技術(shù)在北京及周邊地區(qū)僅首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院已經(jīng)將其應(yīng)用至臨床，并成功對10例患者進行了卵巢組織凍存再移植[5]，其中一位患者實現(xiàn)了自然妊娠[6]，標(biāo)志著該技術(shù)在我國臨床應(yīng)用過程中的零突破。然而仍然有相當(dāng)大一部分患者及醫(yī)務(wù)工作者對卵巢組織凍存這項技術(shù)并不了解，存在著諸多誤解，導(dǎo)致大量需要卵巢組織凍存以保護生殖力的女性患者因?qū)υ摷夹g(shù)不了解而錯失良機。全面評估現(xiàn)階段首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院卵巢組織凍存技術(shù)的臨床應(yīng)用情況，對于今后該技術(shù)在全國的大面積推廣，使得更多患者能夠有機會接觸、了解并最終從中獲益有著重要的參考意義。因此本研究首先對在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院卵巢組織庫進行凍存患者的疾病分布特點以及人口學(xué)資料進行統(tǒng)計分析，初步評估該技術(shù)的總體應(yīng)用情況。然后對比部分患者新鮮組和凍存/復(fù)蘇組卵泡活性計數(shù)的差異，全面驗證該技術(shù)的有效性及穩(wěn)定性。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

將2016年9月至2021年4月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院人卵巢組織凍存庫進行卵巢組織凍存以保護生殖力的患者共217例作為研究對象，收集其年齡、患病類型、地區(qū)、凍存前是否接受了放射治療(以下簡稱放療)及化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)等情況進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。募集其中的46例患者并經(jīng)過充分知情同意后，在凍存前取其卵巢組織的一部分進行相關(guān)研究。每位患者取4個卵巢皮質(zhì)標(biāo)本，采用數(shù)字表法隨機選取其中2個新鮮標(biāo)本到新鮮組進行卵泡活性計數(shù)，剩余的2個標(biāo)本分到程序化凍存復(fù)蘇組進行程序化冷凍/復(fù)蘇后再進行卵泡活性計數(shù)。所有患者進行卵巢組織凍存前卵巢組織常規(guī)送病理，除外卵巢組織內(nèi)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。

1.2 卵巢標(biāo)本制作

卵巢組織獲取后按照標(biāo)準(zhǔn)化流程轉(zhuǎn)運至人卵巢組織凍存庫，由專業(yè)技術(shù)人員在無菌操作臺上，4 ℃環(huán)境下使用無菌刀片去除卵巢髓質(zhì)，僅保留卵巢皮質(zhì)部分。同意進行卵泡活性對比研究的患者使用直徑為 2 mm 的圓形Punch取材器另取其卵巢組織皮質(zhì)標(biāo)本，每人4個。

1.3 程序化凍存/復(fù)蘇

本研究采用程序化凍存，具體冷凍方案參照2007年Isachenko V發(fā)表的相關(guān)論文[7]?；颊叩?個卵巢組織標(biāo)本在4 ℃凍存液中平衡15 min后轉(zhuǎn)移至含有1.8 mL凍存液的無菌凍存管內(nèi)進行程序化冷凍。降溫速度如下：由室溫按照2 ℃/min的速度降至-6 ℃，在-6 ℃時進行人工誘導(dǎo)冰晶形成。然后按照0.5 ℃/min的速度繼續(xù)降溫至溫度達到-40 ℃，最后按照50 ℃/min的速度迅速降至-140 ℃。冷凍完成后將無菌凍存管轉(zhuǎn)移至-196 ℃液氮儲罐中儲存，7 d以后進行復(fù)蘇。

復(fù)蘇采用慢速復(fù)溫法。凍存管從液氮罐取出后在37 ℃水浴箱中快速復(fù)溫后至0 ℃左右，待凍存液大部分融化后將卵巢組織標(biāo)本取出，置于含有不同濃度梯度復(fù)蘇液的6孔板中逐步繼續(xù)復(fù)溫、洗滌。前45 min，每隔15 min更換到6孔板內(nèi)下一個孔，每孔所含復(fù)蘇液的濃度不同。后20 min每隔10 min更換一孔。整個復(fù)蘇過程共更換5次孔位。

1.4 卵泡活性計數(shù)

根據(jù)鈣黃綠素AM(Calcein AM)只能在活細胞中才能被代謝轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生熒光綠色這一特點，本研究使用Calcein AM對每位患者的2個新鮮卵巢組織標(biāo)本和2個凍存/復(fù)蘇后卵巢組織標(biāo)本分別進行染色，再在495 nm熒光顯微鏡下進行卵泡活性計數(shù)。

1.5 試劑配制

凍存液：每100 mL凍存液內(nèi)包含人血清白蛋白(IrvineScience公司，美國)5 mg，10%(體積分?jǐn)?shù))CryoSure-DMSO(WAK-Chemie Medical GmbH)5 mL和Leibovitz’s L-15(Gibco公司，美國)90 mL。

復(fù)蘇液：每100 mL復(fù)蘇液內(nèi)含90 mL DPBS(Gibco公司,美國)和10 mL人血清白蛋白(IrvineScience公司，美國)。前3孔的復(fù)蘇液內(nèi)蔗糖含量分別為0.75 mol/L、0.45 mol/L、0.125 mol/L，后兩孔復(fù)蘇液內(nèi)無蔗糖。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織凍存患者的年齡、地區(qū)分布及凍存前放療及化療比例

217例卵巢組織冷凍保存患者中年齡最小者1歲，最大者47歲，中位年齡32歲，P25和P75分別為27歲和35歲。在這些進行了卵巢組織凍存以保護生殖力的女性患者中以31～35歲為主，占總凍存人數(shù)的36.4%；小于25歲的人群所占比例最小，占總?cè)藬?shù)的19.4%；26～30歲之間及36歲以上的人群占比分別為25.3%和18.9%。

卵巢組織凍存的患者以北京地區(qū)為主，共116例，占總?cè)藬?shù)的53.5%，北京周邊及外省患者共101例，占總?cè)藬?shù)的46.5%。凍存前接受過影響性腺功能的放療和/或化療的患者共計37例，占總?cè)藬?shù)的17.1%，未接受過相關(guān)治療的患者共計180例，占總?cè)藬?shù)的82.9%。

2.2 卵巢組織凍存患者疾病種類及占比

217例進行卵巢組織凍存的患者中宮頸癌是主要患病類型，共計107例(49.31%)，其次是子宮內(nèi)膜癌27例(12.44%)。按照所占比例下降方式排列依次為乳腺癌23例(10.60%,)，白血病12例(5.53%,)，卵巢腫瘤10例(4.61%)，骨髓增生異常綜合征4例(1.84%)，霍奇金淋巴瘤4例(1.84%)，直腸癌3例(1.38%,)，膀胱癌2例(0.92%)，再生障礙性貧血2例(0.92%)，B細胞淋巴瘤2例(0.92%)，陰道癌2例(0.92%)，其他疾病包括脂肪肉瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、范科尼貧血、血小板功能異常、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良等共計19例(8.76%)(圖1)。

圖1 卵巢組織凍存患者疾病類型及所占比例Fig.1 The disease type and proportion of the patients with ovarian tissue cryopreservation MDS: myelodysplastic syndromes.

2.3 程序化凍存/復(fù)蘇卵泡活性計數(shù)

46例同意進行卵巢組織活性計數(shù)對比研究的患者中年齡最小者16歲，最大者41歲，平均年齡(32.2±6.9)歲。新鮮卵巢組組的卵泡活性計數(shù)為59.04±78.067，凍存/復(fù)蘇組卵泡活性計數(shù)為50.59±62.942，兩組卵泡活性計數(shù)比較，凍存復(fù)蘇組卵泡計數(shù)雖然在一定程度上有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。兩組卵泡活性檢測典型圖片見圖2。

圖2 新鮮卵巢組織與復(fù)蘇后卵巢組織卵泡活性檢測典型圖片F(xiàn)ig.2 Typical pictures of follicular activity in the fresh and frozen-thawed ovarian tissue

表1 新鮮卵巢組織組和凍存/復(fù)蘇組卵泡活性計數(shù)比較

3 討論

卵巢組織凍存最佳適應(yīng)證之一是乳腺癌。這是因為幾乎在所有乳腺癌診療指南所推薦的輔助化療方案中幾乎都包含了環(huán)磷酰胺[8]，而環(huán)磷酰胺是一種生殖毒性最強的烷化劑之一，導(dǎo)致年輕女性術(shù)后的實際妊娠率不足5%[9]。因此，在歐洲最大的生殖力保護中心—FertiPROTEKT網(wǎng)絡(luò)中心(包括德國、奧地利和瑞士等在內(nèi)的85個中心)進行生殖力保護的4 060名婦女中，乳腺癌癥患者高達41%[10]。然而，本研究卻發(fā)現(xiàn)在本院進行卵巢組織凍存的患者就疾病類型而言，以宮頸癌為主，幾乎占到所有凍存人數(shù)的一半，其次是子宮內(nèi)膜癌，乳腺癌僅排第三。這一現(xiàn)象一方面與中國乳腺癌發(fā)病率低于歐美國家有關(guān)。另一方面與卵巢組織凍存技術(shù)在中國開展?fàn)顩r及認(rèn)知程度有關(guān)。在中國能夠進行專業(yè)地卵巢組織凍存生殖力保護的醫(yī)院寥寥無幾，而北京婦產(chǎn)醫(yī)院已經(jīng)成功地完成了中國首例凍存卵巢組織再移植手術(shù)，在接受卵巢組織再移植手術(shù)的10例患者中更是有一位已經(jīng)自然妊娠[5-6,11-13]，這就決定了卵巢組織凍存技術(shù)的推廣在某種程度上在北京及其周邊地區(qū)是以北京婦產(chǎn)醫(yī)院為中心向外擴展。在現(xiàn)有的推廣模式下，了解和接受卵巢組織凍存技術(shù)相關(guān)信息最快、最完整的人群是婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)部婦科腫瘤科的醫(yī)護人員及需要進行生育力保護的婦科腫瘤患者。這部分患者以宮頸癌為主，導(dǎo)致了現(xiàn)階段進行卵巢組織凍存的患者中宮頸癌占據(jù)了很大比例。宮頸癌患者雖然因為原發(fā)疾病需要全子宮切除或多次放療，失去受孕的機會，但在原發(fā)病緩解之后進行卵巢組織再移植可以幫助患者恢復(fù)內(nèi)分泌的功能，大大提高患者的生命質(zhì)量，減少相關(guān)激素藥物的使用，因此宮頸癌也是進行卵巢組織凍存的適應(yīng)證之一。

在中國,人們對卵巢組織凍存技術(shù)普遍認(rèn)知有限，具體表現(xiàn)在許多臨床醫(yī)生包括乳腺科醫(yī)生本身認(rèn)為保留生育能力與保命是相抵觸的，抑或是生育能力的保留是可有可無的事情，持有無所謂的態(tài)度。部分凍存患者在進行卵巢組織凍存前已經(jīng)接受了多次的放化療，卵巢功能已經(jīng)遭受一定程度的破壞，導(dǎo)致了大量年輕甚至于年幼需要生殖力保護的女性癌癥患者失去生殖力保護的良機，或是保護效果欠佳，失去做母親或者保留內(nèi)分泌功能的最后機會。鑒于此種情況，醫(yī)務(wù)人員可以借助宣傳冊、網(wǎng)絡(luò)平臺、科普講座等方式，在全國范圍內(nèi)大力普及人卵巢組織凍存技術(shù)相關(guān)知識，幫助醫(yī)務(wù)工作者意識到生殖力保護的必要性和可行性，讓需要進行生殖力保護的年輕女性患者了解到還有一種新的選擇和希望。

卵巢組織凍存是一種運用低溫生物學(xué)原理從而達到冷凍保存卵巢組織的方法，在凍存過程中不可避免出現(xiàn)細胞內(nèi)冰晶形成所帶來的損傷和高溶液濃度導(dǎo)致的溶液損傷。目前，國際上大部分報道經(jīng)過程序化冷凍/復(fù)蘇后，卵巢組織內(nèi)活性卵泡的存活率為70%～80%[13-14]，本研究對比了新鮮卵巢組織組和程序化冷凍/復(fù)蘇后組卵巢組織內(nèi)活性卵泡計數(shù)的變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，再次證實了卵巢組織凍存技術(shù)能夠有效地保存卵巢組織內(nèi)的卵泡，與國際水平相似，能夠為患者生殖力的有效保存及日后卵巢組織再移植后實現(xiàn)內(nèi)分泌功能的恢復(fù)甚至妊娠意愿提供了必要的基礎(chǔ)。

結(jié)論：北京婦產(chǎn)醫(yī)院進行卵巢組織凍存人群的疾病類型主要是宮頸癌。卵巢組織凍存技術(shù)能夠有效地保存患者的生育力。