付曉宇，劉建民

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 錦州 121000)

強(qiáng)直性脊柱炎是一種病因尚不清楚的慢性風(fēng)濕免疫性疾病，診斷時(shí)間長(zhǎng)、當(dāng)前可用療法的相對(duì)不足都迫切需要對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理有更深入的了解。疾病早期表現(xiàn)為炎性腰背痛，休息后或夜間加重，活動(dòng)后減輕。隨著疾病的發(fā)展，患者逐漸由出現(xiàn)骶髂至脊柱、髖關(guān)節(jié)的異位骨化，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊、脊柱周圍韌帶等等非骨質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的異位骨化。疾病晚期特征性的脊柱“竹節(jié)樣變”和髖關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直融合是致畸、致殘的關(guān)鍵原因[1-2]，不僅限制患者身體活動(dòng)范圍并帶來(lái)難以忍受的疼痛，還會(huì)影響患者的心理健康[3]。雖然具體機(jī)制尚不明確，但研究表明，AS的疾病發(fā)展主要包括炎癥和新骨形成兩個(gè)階段[4]，TNF-α對(duì)AS的炎癥發(fā)展起重要作用，目前腫瘤壞死因子拮抗劑是治療AS的主要藥物[5]。在對(duì)AS的早期抗炎治療中，雖能有效緩解強(qiáng)直性脊柱炎的早期癥狀[6]，但并沒(méi)有完全阻止晚期異位骨化的進(jìn)展。反映AS的炎癥過(guò)程能促進(jìn)異位骨化，但二者是兩個(gè)相互獨(dú)立的過(guò)程[7]。作為重要的細(xì)胞因子，IL-18與TNF-α在強(qiáng)直性脊柱炎患者血清中表達(dá)水平呈正相關(guān)[8]。IL-18是否參與了AS的發(fā)生發(fā)展，是通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)異位骨化，還是直接參與異位骨化并不清楚。本實(shí)驗(yàn)用檢測(cè)T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞中IL-18、IL-18R及IL-18BP的表達(dá)水平，探究IL-18、IL-18R及IL-18BP是否參與AS疾病發(fā)生，以及其主要的效應(yīng)細(xì)胞，希望可以為延緩或抑制強(qiáng)直性脊柱炎骨化進(jìn)展提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

嚴(yán)格按照1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)及骶髂關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)[9]，選擇2018年12月至2019年12月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的45例強(qiáng)直性脊柱炎患者，并排除其他風(fēng)濕免疫性疾病等疾病。X線表現(xiàn)II級(jí)及以下為疾病早期組有24人，其中男性18例，女性6例，年齡18～57歲；III級(jí)及IV級(jí)為疾病晚期組有21人，其中男性16例，女性5例，年齡18～57歲。選擇同時(shí)期在該院進(jìn)行體檢的45例健康人作為健康對(duì)照組(healthy control，HC)，其中男性30例，女性15例，年齡18～57歲。兩組受試者均知情同意本次研究。本研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，兩組性別、年齡構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的一般資料

1.2 方法

1.2.1 收集血液樣本

抽取所有受試者3 mL空腹靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

1.2.2 采用全自動(dòng)血沉分析儀檢測(cè)血漿ESR水平

采用免疫透射比濁法檢測(cè)血清CRP水平，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALP水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-18水平。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

離心棄上清后加入死細(xì)胞去除液和人Fc受體阻斷劑，室溫避光孵育15 min，依次加入抗CD4、CD8、CD16、CD19、CD14和抗IL-18R抗體，避光孵育15 min后裂解紅細(xì)胞離心，用固定/透明液固定細(xì)胞，依次加入抗IL-18抗體和抗IL-18BP抗體孵育30 min，透膜洗液清洗后加入BV510耦合驢抗兔Ig-G抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞的IL-18R、IL-18、IL-18BP的表達(dá)[10-11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血中CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平

AS組外周血中CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平較健康組高(P<0.05)，TNF-α、IL-18、ALP在疾病晚期組較疾病早期組高(P<0.05)，且TNF-α與IL-18兩者正相關(guān)(P=0.007，r=0.4887)，CRP、ESR在疾病早期組與疾病晚期組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2～4。

表2 AS組與健康對(duì)照組CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平比較

表3 疾病早期組與疾病晚期組CRP、ESR、TNF-α、ALP、IL-18水平比較

表4 AS組CRP、ESR、TNF-α、ALP與IL-18的相關(guān)性分析

2.2 在強(qiáng)直性脊柱炎異位骨化患者外周血中表達(dá)IL-18的CD14+單核細(xì)胞比例升高

結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，在強(qiáng)直性脊柱炎異位骨化患者外周血中IL-18+單核細(xì)胞比例升高，IL18+的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD16+中性粒細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞的MFI升高，見(jiàn)圖1～2。

圖1 健康組與強(qiáng)直性脊柱炎組外周血IL-18+細(xì)胞的百分比

圖2 健康組與強(qiáng)直性脊柱炎組外周血各細(xì)胞IL-18 MFI的表達(dá)變化

2.3 在強(qiáng)直性脊柱炎異位骨化患者外周血中表達(dá)IL-18R的CD8+T細(xì)胞水平及CD8+T細(xì)胞IL-18R的MFI明顯升高

AS異位骨化患者組與健康對(duì)照組相比，表達(dá)IL-18R的CD8+T細(xì)胞比例及IL-18R+CD8+T細(xì)胞的MFI明顯升高，表達(dá)IL-18R的CD4+T細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、CD16+中性粒細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞的細(xì)胞比例及MFI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3～4。

圖3 健康組與強(qiáng)直性脊柱炎組外周血IL-18R+細(xì)胞的百分比

圖4 健康組與強(qiáng)直性脊柱炎組外周血各細(xì)胞IL-18R MFI的表達(dá)變化

2.4 在強(qiáng)直性脊柱炎異位骨化患者外周血中IL-18BP+CD8+T細(xì)胞的MFI降低

結(jié)果顯示，較健康對(duì)照組，AS異位骨化患者外周血中IL-18BP+CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞比例升高，MFI降低；IL-18BP+CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MFI降低；CD14+單核細(xì)胞、CD16+中性粒細(xì)胞的細(xì)胞比例及MFI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-18BP+CD19+B細(xì)胞比例下降，MFI升高，見(jiàn)圖5～6。

圖5 健康組與強(qiáng)直性脊柱炎組外周血IL-18BP+細(xì)胞的百分比

圖6 健康組與強(qiáng)直性脊柱炎組外周血各細(xì)胞IL-18BP MFI的表達(dá)變化

3 討 論

強(qiáng)直性脊柱炎是一種好發(fā)于青壯年的致畸致殘的慢性風(fēng)濕免疫性疾病，存在炎癥和骨化兩個(gè)階段。炎癥在AS疾病早期開始出現(xiàn)，加重骨破壞，促進(jìn)新骨形成[12]。但炎癥與新骨形成是兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)又相互獨(dú)立的過(guò)程，目前抑制炎癥的主要藥物抗TNF-α并不能完全阻止骨化，說(shuō)明AS可能不止通過(guò)TNF-α介導(dǎo)的炎癥來(lái)促進(jìn)異位骨化。TNF-α、CRP、ESR作為重要的炎癥檢測(cè)指標(biāo)，相關(guān)研究表明三者與AS的疾病嚴(yán)重程度和抗TNF-α治療后療效呈相關(guān)性，可以作為AS疾病嚴(yán)重程度輔助檢測(cè)指標(biāo)[13-14]。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)，CRP、ESR、TNF-α在AS組較健康對(duì)照組高，TNF-α在疾病晚期組較疾病早期組高。正常人體內(nèi)通過(guò)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，維持著骨組織的正常生長(zhǎng)。一旦這種穩(wěn)態(tài)被打破，就會(huì)有異常的骨侵蝕或異位骨化[15]。新骨形成過(guò)程包含軟骨細(xì)胞被成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞取代、成纖維細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。主要由成骨細(xì)胞分泌的ALP，通過(guò)促進(jìn)磷酸鈣在骨中沉積，影響骨組織生成[16]。本研究中，ALP在AS組較健康組高，在疾病晚期組較疾病早期組高，可能與AS的異位骨化相關(guān)，且在疾病晚期較疾病早期，異位骨化程度加重。

IL-18是一種多效性細(xì)胞因子，是IL-1家族成員，可由T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，可同時(shí)參與調(diào)節(jié)先天和后天的免疫應(yīng)答[17]。AS作為遺傳性疾病，HLA B27是已知的作為診斷AS的輔助檢測(cè)指標(biāo)[18]。相關(guān)研究表明，AS的患者的滑液和外周血中有HLA B27限制性CD8+T細(xì)胞的表達(dá)[19]。而IL-18在抗原呈遞過(guò)程中對(duì)T細(xì)胞的活化具有多效性作用。IL-18最初確定為自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞IFN-γ的有效誘導(dǎo)劑，與Th1反應(yīng)有關(guān)。而IFN-γ會(huì)使髓樣細(xì)胞的分化從破骨細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移。IL-18通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的分化而發(fā)揮類似的作用。IL-18還可以以宿主微環(huán)境依賴性方式調(diào)節(jié)Th2和Th17細(xì)胞反應(yīng)及CD8+細(xì)胞毒性細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的活性[20]。本次研究結(jié)果顯示，IL-18在AS組的表達(dá)水平比健康對(duì)照組高，在疾病晚期組中較疾病早期組高，且與炎性指標(biāo)TNF-α呈正相關(guān)，提示IL-18可能通過(guò)影響TNF-α的水平參與AS的炎癥過(guò)程。

IL-18R作為IL-18的受體，IL-18與其結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)，IL-18R主要在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中產(chǎn)生。Yu W等[21]的研究表明，IL-18R在成骨和AS發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。IL-18BP作為IL-18的天然抑制蛋白，通過(guò)與IL-18結(jié)合，降低IL-18R表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞的功能。在生物體中，IL-18的生物活性取決于IL-18產(chǎn)生的強(qiáng)度、IL-18BP的水平以及IL-18R的細(xì)胞表面表達(dá)水平，三者保持相對(duì)的穩(wěn)態(tài)，維持機(jī)體正常[22]。

本次研究中，AS組外周血CD8+T細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞及CD16+中性粒細(xì)胞中IL-18表達(dá)增強(qiáng)，提示AS患者外周血IL-18水平升高可能與CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞IL-18表達(dá)增高有關(guān)。AS組IL-18R+CD8+T細(xì)胞比例及MFI明顯升高，表明CD8+T細(xì)胞可能作為強(qiáng)直性脊柱炎異位骨化患者體內(nèi)分泌的IL-18的主要效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮生物效應(yīng)。提示CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌的IL-18參與AS炎癥的進(jìn)展。外周血IL-18BP+CD8+T細(xì)胞在AS組中表達(dá)水平降低，提示在AS患者外周血中IL-18的生物活性增強(qiáng)可能與IL-18BP表達(dá)減少有關(guān)。

綜上所述，IL-18的過(guò)度表達(dá)與IL-18BP的表達(dá)降低，影響IL-18與IL-18BP的平衡，參與AS的炎癥階段，CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18、IL-18R、IL-18BP可能通過(guò)參與強(qiáng)直性脊柱炎的炎癥進(jìn)展促進(jìn)AS的異位骨化。研究CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18及IL-18BP可能會(huì)為治療TNFi療效不佳的患者提供新的治療方法。