梁春光，黃雷，佟彤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院；2.錦州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 錦州 121000)

促尿皮質(zhì)素(UCN)是在1995年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)神經(jīng)肽，與UCNⅡ和UCNⅢ是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing factor，CRF)的家族成員，通過(guò)與CRF受體結(jié)合而發(fā)揮其生理作用。UCN能夠與CRF受體1和2結(jié)合，而UCNⅡ和UCNⅢ與CRF受體2具有更高的結(jié)合能力。研究發(fā)現(xiàn)，UCN對(duì)心臟具有保護(hù)作用，是一個(gè)很重要的心血管活性肽[1]。UCN對(duì)心臟具有正性肌力作用、缺血再灌心肌的保護(hù)作用及促進(jìn)心肌肥厚作用。而且大量實(shí)驗(yàn)也表明，UCN的心血管作用與細(xì)胞內(nèi)Ca2+機(jī)制有關(guān)[2-3]，而且Ca2+信號(hào)在心肌肥厚和基因表達(dá)發(fā)揮著重要作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，L-型Ca2+通道阻滯劑維拉帕米能夠抑制異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的心肌肥厚[6]。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)多次報(bào)道了不同藥物對(duì)心肌細(xì)胞的肥大作用的作用機(jī)制[7-9]。而UCN同源肽誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大與鈣離子之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。

心肌肥厚是高血壓、心衰后心肌的一種代償性表現(xiàn)，是心臟病人猝死的一種重要的危險(xiǎn)因素，所以心肌肥厚的相關(guān)研究受到了學(xué)者的重視。本研究將進(jìn)一步探討尿皮質(zhì)素同源肽誘導(dǎo)心肌肥厚可能的作用機(jī)制，通過(guò)比較尿皮質(zhì)素同源肽誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，觀察尿皮質(zhì)素同源肽誘導(dǎo)心肌肥大與心肌細(xì)胞[Ca2+]i的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 藥品與試劑

UCN，UCNⅡ，UCNⅢ及異丙腎上腺素(ISO)均為美國(guó)Sigma公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、小牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為杭州四季青生物工程材料有限公司；ANP一抗：Millipore公司；[3H]亮氨酸為上海原子核研究所產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的出生2～4 d的SD大鼠的乳鼠完成，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄不受限制。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境下，將剛出生2～4 d的乳鼠心臟取出，然后放在Hanks液里面，反復(fù)沖洗3次，使用滅菌小剪刀迅速將心臟剪成小碎塊，再使用胰酶(0.8 g/L)在磁力攪拌下消化分散細(xì)胞，將分散后得的心肌細(xì)胞加入含84%DMEM培養(yǎng)基和15%小牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有100 mg/L鏈霉素和1×100 Ku/L青霉素雙抗。將細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)反復(fù)吹打，吹打均勻后將細(xì)胞以1×109/L的接種密度接種于24孔培養(yǎng)板上，放入通以95%空氣及5%CO2的孵箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 分組及給藥方法

心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行細(xì)胞換液，換液降低血清濃度是為了減少血清成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，更換的液體為含0.04% 小牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中按照實(shí)驗(yàn)分組加入各種濃度的試劑。實(shí)驗(yàn)分成正常對(duì)照組、ISO組(10 μmol/L)、UCN組(0.1 μmol/L)、UCNⅡ組(0.1 μmol/L)、UCNⅢ組(0.1 μmol/L)。各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定時(shí)間為給藥后48 h。

1.5 培養(yǎng)心肌細(xì)胞體積的測(cè)量

通過(guò)測(cè)量細(xì)胞直徑獲得培養(yǎng)的心肌細(xì)胞體積。取出培養(yǎng)板，將長(zhǎng)滿(mǎn)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)孔用D-Hanks液快速?zèng)_洗3次，然后每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.3 mL胰酶(1 g/L)，將培養(yǎng)板再次放入37 ℃恒溫箱中消化30 min，取出培養(yǎng)板終止消化，方法是在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.2 mL含有0.1體積分?jǐn)?shù)血清的培養(yǎng)基；將消化下來(lái)的細(xì)胞完全收集，注入底部放置一個(gè)經(jīng)硅化的蓋玻片的細(xì)胞室內(nèi)，硅化的蓋玻片可以防止心肌細(xì)胞貼壁；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，顯微鏡放大400倍，心肌細(xì)胞均呈圓球形。測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的直徑，按照文獻(xiàn)方法計(jì)算出單個(gè)細(xì)胞的體積，每組檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)見(jiàn)文獻(xiàn)[9]65-68。

1.6 測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成

將培養(yǎng)48 h 后已經(jīng)成活的心肌細(xì)胞，更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有37 TBq/L [3H]亮氨酸及不同濃度UCN等試劑。加藥后再培養(yǎng)48 h 。棄去培養(yǎng)液，冷Hank液沖洗細(xì)胞3 遍。使用1 mL SDS(10 g/L)溶解細(xì)胞，使用三氯醋酸(50 g/L)沉淀蛋白。應(yīng)用GF/C過(guò)濾，烘干濾膜，放置在含有體積分?jǐn)?shù)為4×10-3PPO的二甲苯溶液的閃爍杯中。用液閃儀測(cè)量[3H] 亮氨酸的結(jié)合，分析蛋白的合成。每個(gè)孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表示見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

1.7 測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的含量

棄掉培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks液快速?zèng)_洗3次后，加入0.5 mL SDS(10 g/L)溶解細(xì)胞。每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)約為5×105個(gè)，使用Lowry方法測(cè)定每孔心肌細(xì)胞的蛋白含量。

1.8 Western蛋白印跡法測(cè)定心肌細(xì)胞ANP的表達(dá)

細(xì)胞加藥培養(yǎng)48 h后，取樣備用。取出樣品加入PMSF(10 g/L)，超聲裂解離心后取上清。應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。上樣緩沖液并煮沸。10 μL樣品以及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物點(diǎn)樣。垂直電泳3～5 h，轉(zhuǎn)膜8～12 h；封閉，洗膜，稀釋后的兔抗大鼠ANP(1∶200)室溫反應(yīng)2 h，二抗(1∶1500)反應(yīng)1 h，顯影劑顯影。顯影條帶處理方式及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示方式見(jiàn)文獻(xiàn)[9,11]65-68。

1.9 培養(yǎng)心肌細(xì)胞鈣離子瞬間變化([Ca2+]i)的測(cè)定

將生長(zhǎng)有自發(fā)性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞的蓋玻片置于含有Fura-2/AM(3 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃水浴中避光孵育30 min后，取出蓋玻片，用HEPES緩沖液沖洗。將蓋玻片放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，用恒溫37 ℃灌流速度為1 mL/min 的HEPES緩沖液灌流，并按照指定時(shí)間于灌流液中加入實(shí)驗(yàn)用藥。TiLL陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)為測(cè)定儀器。激發(fā)光波長(zhǎng)分別為340 nm及380 nm，300 ms為采樣間隙。計(jì)算心肌細(xì)胞[Ca2+]i的方法見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 UCN同源肽對(duì)心肌細(xì)胞體積的影響

與正常對(duì)照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞體積分別增加了56.6%、32.9%、57.8%和31.4%，與ISO的肥大作用相比，UCNⅡ心肌細(xì)胞體積增加的程度更大，增加了57.8%。UCN及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞體積增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

藥物同時(shí)分別加入不同組別培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞；與對(duì)照組比較，##P<0.01

2.2 UCN同源肽對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響

與正常對(duì)照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成分別增加了77.02%、39.8%、47.3%和38.4%。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

2.3 UCN同源肽對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響

與正常對(duì)照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成分別增加了56.2%、33.3%、17.6%和30.3%。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組比較，##P<0.01

與對(duì)照組比較，##P<0.01

2.4 UCN同源肽對(duì)心肌細(xì)胞ANP表達(dá)含量的影響

與正常對(duì)照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞ANP表達(dá)含量明顯增加了。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細(xì)胞ANP表達(dá)含量增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖4。

2.5 UCN同源肽對(duì)心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬間變化的影響

ISO及UCN同源肽均未明顯改變正常心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬間變化。ISO及UCN同源肽能夠增高心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬間變化的幅度，但是基線(xiàn)水平?jīng)]有變化，增快了心肌細(xì)胞自發(fā)頻率，對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣的負(fù)荷均無(wú)影響，其中ISO的作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖5。

A：ANP蛋白表達(dá)和β-actin 蛋白表達(dá)；B：ANP/β-actin 半定量結(jié)果；與對(duì)照組比較，#P<0.05

A：心肌細(xì)胞內(nèi)代表性Ca2+變化曲線(xiàn)，UCN同源肽對(duì)靜息[Ca2+]i 水平；B：Ca2+ 變化幅度；C：Ca2+的定量分析；D：頻率，與正常對(duì)照組比較，#P<0.05

3 討 論

心肌肥厚作用是心臟的一種很重要的調(diào)整機(jī)制，是心臟負(fù)荷過(guò)重時(shí)一種代償表現(xiàn)，是心肌細(xì)胞對(duì)高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死等常見(jiàn)臨床疾病的一種基本反應(yīng)。以上心臟疾病的初始階段，心臟通過(guò)平衡應(yīng)激的增加改善心臟的功能使心肌肥厚，但是長(zhǎng)時(shí)間的壓力會(huì)導(dǎo)致心肌持續(xù)性增厚，最終心臟功能會(huì)嚴(yán)重失衡從而發(fā)生心力衰竭，因此成為心血管病患者死亡的重要原因之一。因此研究心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和確定此作用中的調(diào)節(jié)因子非常重要。

許多研究已經(jīng)表明，UCN同源肽是很重要的心血管活性肽。有研究說(shuō)明UCN正性肌力作用的分子機(jī)制主要通過(guò)cAMP-PKA信號(hào)途徑介導(dǎo)[13]。許多研究表明，UCN具有心肌的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可以通過(guò)MAPK p42/44[2]568-571、PI3K-Akt[14]、PKCε[15]等信號(hào)途徑介導(dǎo)。許多研究已經(jīng)表明，[Ca2+]i變化是心肌肥大的一個(gè)信號(hào)。多種鈣調(diào)節(jié)酶?jìng)鲗?dǎo)不同的作用信號(hào)從而出現(xiàn)[Ca2+]i的改變，其中Ca2+/CaMK家族中的鈣調(diào)素依賴(lài)蛋白激酶就是最重要的一種酶，在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4,9]1314-1321,65-68。PKC是一種依賴(lài)Ca2+、磷脂的蛋白激酶，可以與Ca2+相互調(diào)節(jié)而達(dá)到基因表達(dá)和細(xì)胞增殖等長(zhǎng)期反應(yīng)。

異丙腎上腺素是一個(gè)公認(rèn)的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的試劑，本實(shí)驗(yàn)將UCN同源肽與異丙腎上腺素的致心肌細(xì)胞肥大作用進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在UCN同源肽中，UCNⅡ的致心肌細(xì)胞肥大作用最強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道[16]結(jié)果一致。

綜上所述，UCN同源肽與異丙腎上腺素一樣能夠使心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。UCN同源肽使心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬間變化幅度增高，但不影響基線(xiàn)水平，對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣負(fù)荷均無(wú)影響，使心肌細(xì)胞自發(fā)頻率加快，說(shuō)明UCN同源肽致心肌細(xì)胞肥大可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)起作用。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道UCN可以通過(guò)影響蛋白激酶A信號(hào)途徑，影響L-型鈣通道改變心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)起到致心肌細(xì)胞肥大作用[17]。但是對(duì)于UCNⅡ及UCNⅢ引起鈣離子改變是首次研究。細(xì)胞內(nèi)鈣離子發(fā)生改變，可能由于細(xì)胞內(nèi)鈣釋放還能是細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，但是UCN同源肽引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子改變的具體機(jī)制尚未明了，還需要具體研究。UCN同源肽致心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制研究曾發(fā)現(xiàn)它們是通過(guò)不同的信號(hào)通路完成的，那么它們引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子改變是否通過(guò)不同的機(jī)制尚需要研究。