孫大鵬，李晨光，張鳳香

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121000)

乳腺癌是女性癌癥中最常見的惡性腫瘤之一。目前主要治療方式為手術、放療、化療和生物治療，但這些治療方法均存在著一些不足之處。近有研究證實，在乳腺癌組織中存在少量的乳腺癌干細胞，它不但具有高致瘤性和高侵襲轉移性等特點，同時還具有對化療和放療抵抗性的特點，其在乳腺癌的發(fā)生﹑發(fā)展、轉移和復發(fā)中起著十分重要的作用。因此，尋找乳腺癌干細胞的生物學標記物，研發(fā)相應的分子靶向藥物，開展多位點靶向藥物治療，已成為目前乳腺癌研究的重點內(nèi)容之一。

鈣網(wǎng)蛋白(CALR)是一種多功能的鈣結合分子伴侶，主要存在于內(nèi)質網(wǎng)中。在多種腫瘤組織中改變鈣網(wǎng)蛋白的表達水平，對不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展起不同的調節(jié)作用[1]。研究[2]證實，在U87膠質瘤細胞中鈣網(wǎng)蛋白的表達變化能明顯影響細胞的增殖、侵襲，誘導細胞凋亡及膠質瘤組織中血管的生成。在乳腺癌MDA-MB-231干細胞中，有研究[3]顯示，鈣網(wǎng)蛋白表達上調并主要定位于胞漿內(nèi)，在高侵襲性的MDA-MB-231干細胞內(nèi)鈣網(wǎng)蛋白的表達水平顯著高于弱侵襲性的MCF-7干細胞。microRNAs是真核生物中廣泛存在的一類長度為19～25個核苷酸的非編碼RNA分子，參與調控個體發(fā)育、增殖、分化及細胞凋亡等過程[4-5]。miR-206是一個典型的多功能microRNA，位于非編碼基因Bic內(nèi)，在多種腫瘤細胞中均有表達。研究[6]報道，miR-206在雌激素受體α陽性的乳腺癌MDA-MB-231干細胞中表達下調；在乳腺癌MDA-MB-231干細胞中高表達的miR-206能夠有效抑制細胞生長。雖然這些研究表明miR-206在乳腺癌干細胞的發(fā)生、發(fā)展過程中起到十分重要的作用，但仍不十分清楚其如何調節(jié)乳腺癌干細胞的生長。本研究主要探討了miR-206通過干擾乳腺癌干細胞上CALR的表達來影響乳腺癌干細胞生物學活性的可能機制，進而為乳腺癌的防治提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人MDA-MB-231乳腺癌細胞購自中國科學院細胞庫；miR-206模擬物、抗CALR蛋白和抗N-鈣粘蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，四甲基偶氮唑藍(dimethylthiazolyl-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)購自美國Biosharp公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠 IgG購自中杉金橋有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購自康為世紀公司，BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)

胰蛋白酶消化，收獲MDA-MB-231細胞，用抗人CD44-熒光素異硫氰酸酯，抗人CD24-藻紅蛋白和抗人ESA-PerCP-Cy5.5-A抗體標記細胞20 min。將乳腺癌干細胞置于有20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子，10 μg/L表皮生長因子和2%B27的DMEM / F12(1∶1)培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2溫育下培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖能力

將2×103個乳腺癌MDA-MB-231細胞接種在96孔板中，用50 nM miR-206或/和Ad-CALR構建體轉染，并孵育48 h。除去上清液，向各孔中加入MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)3 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，避光，恒溫振蕩器上振10 min，室溫孵育20 min。放入酶標儀，以490 nm波長檢測光密度(OD)值。

1.4 流式細胞術檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡情況

用含0.02%的EDTA和0.25%胰酶進行消化，調整細胞濃度至1×106，以冷PBS洗2次并用1×Binding Buffer重懸。取195 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后間隔3 min，再加入10 μL 或20 μg/mL的PI溶液，振蕩后于室溫下避光靜置15 min，每管加入400 μL 1×Binding Buffer，染色后上流式細胞儀進行檢測。

1.5 Western blotting實驗檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)相關蛋白的表達

用50 nM miR-206或/和Ad-CALR構建體轉染，孵育48 h。RIPA裂解緩沖液分離總蛋白。將等量的蛋白質加載到8%SDS-PAGE凝膠上并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，然后與抗CALR(1∶500)，抗N-鈣粘蛋白(1∶1000)一起溫育。在TBST緩沖液后，將膜與綴合辣根過氧化物酶的第二抗體以1∶5000的濃度溫育1 h。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 miR-206 mimics和/或Ad-CALR對乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)CALR表達的影響

Western blotting實驗檢測結果顯示，作用48 h后，miR-206mimics組乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)CALR的表達被明顯抑制(P<0.05)；miR-206 mimics+Ad-CALR組和Ad-CALR組乳腺癌MDA-MB-231細胞中CALR的表達則均被明顯增強(P<0.05)，見圖1。

1：空白對照組；2：Ad-CALR；3：miR-206 mimics+Ad-CALR；4：miR-206 mimics

2.2 miR-206 mimics和/或Ad-CALR對乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長影響

MTT檢測結果顯示，miR-206 mimics作用乳腺癌MDA-MB-231細胞48 h后，細胞增殖抑制率為(52.96±3.12)%，與空白對照組比較有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-206 mimics+Ad-CALR組和Ad-CALR組作用乳腺癌MDA-MB-231細胞48 h后，細胞增殖抑制率分別為(26.64±1.78)%和(24.17±1.56)%，與空白對照組比較差異均有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結果表明，miR-206可以明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長，但當增強CALR的表達時miR-206這種抑制MDA-MB-231細胞生長的作用被明顯降低，見圖2。

圖2 miR-206通過下調CALR表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖

2.3 miR-206 mimics和/或Ad-CALR對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，miR-206 mimics作用MDA-MB-231細胞48 h后，細胞凋亡率為(21.96±1.72)%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-206mimics+Ad-CALR和Ad-CALR作用乳腺癌MDA-MB-231干細胞48 h后，細胞凋亡率分別為(6.93±0.41)%和(7.12±0.67)%，與空白對照組比較差異均統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結果表明，miR-206可以明顯促進MDA-MB-231細胞凋亡，但當增強CALR的表達時，miR-206這種促進細胞凋亡的作用反而明顯降低，見圖3。

2.4 miR-206 mimics和/或Ad-CALR影響乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)相關蛋白的表達

Western blotting實驗檢測結果顯示，與空白對照組比較，miR-206 mimics組乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)E-cadherin的表達被增強，而N-cadherin的表達被抑制(P<0.05)；miR-206 mimics+Ad-CALR組和Ad-CALR組乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)E-cadherin的表達被明顯抑制，而N-cadherin的表達被明顯增強(P<0.05)。上述結果表明，miR-206可以通過增強CALR的表達來調控其EMT相關基因的表達，見圖4。

A：空白對照組；B：Ad-CALR；C：miR-206 mimics+Ad-CALR；D：miR-206 mimics

1：空白對照組；2：miR-206 mimics；3：miR-206 mimics+Ad-CALR；4：Ad-CALR

3 討 論

最近有研究證實[7-8]，在乳腺癌組織中存在少量的乳腺癌干細胞，它不但具有高致瘤性和高侵襲轉移性等特點，同時還具有對化療和放療抵抗性的特點，其在乳腺癌的發(fā)生﹑發(fā)展、轉移和復發(fā)中起著十分重要的作用。正常情況下，miR-206表達于肺癌、胃癌、乳腺癌及結腸癌等多種腫瘤細胞中。miR-206可以通過調節(jié)腫瘤細胞內(nèi)不同信號通路的表達水平來影響腫瘤細胞的活性，進而調控腫瘤的形成[9-10]。在乳腺癌組織中，CALR的表達水平與腫瘤大小和轉移程度正相關，CALR的表達可作為輔助的生物標記物，指導診斷、治療并判斷預后[11-13]。

本研究首先通過Western blotting檢測觀察乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)CALR的變化情況。結果顯示，miR-206 mimics顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)CALR的表達。該研究結果表明，增強miR-206的表達可以明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)CALR的表達水平。轉染miR-206 mimics的乳腺癌MDA-MB-231細胞中發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡明顯增加，細胞的增殖能力明顯被抑制。而轉染Ad-CALR的乳腺癌干細胞則剛好出現(xiàn)相反的結果。同時共轉染miR-206 mimics+ Ad-CALR后乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡數(shù)量較單獨轉染miR-206 mimics比較也明顯下降，而乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和侵襲能力明顯增強。但與單獨轉染 Ad-CALR比較無明顯變化。上述研究結果不但證實miR-206與CALR在調節(jié)乳腺癌MDA-MB-231細胞的生物學活性過程中起到十分重要作用，同時還提示miR-206這種調控乳腺癌MDA-MB-231細胞生物學活性的作用很可能是通過影響CALR的表達來實現(xiàn)的。

EMT在乳腺癌的轉移和侵襲過程中起著十分重要的作用。研究[14-16]證實，許多miRNAs能夠通過調控EMT的活性來影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進程。本研究發(fā)現(xiàn)，增強miR-206的表達能夠明顯促進E-cadherin的表達，同時降低N-cadherin的表達，但當CALR的表達被增強時miR-206的這種作用則被逆轉。上述結果說明，miR-206應該是通過影響EMT內(nèi)CALR的表達來實現(xiàn)對乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)E-cadherin和N-cadherin蛋白活性的調控。

綜上所述，miR-206可能是通過抑制CALR的表達來降低乳腺癌MDA-MB-231細胞生物活性，最終阻止乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究不僅闡述了miR-206調控乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)CALR表達的作用機制，而且為乳腺癌的防治提供了新靶點。