黃斌 胡燕珍 李雪 吳先昊 王亞敏 陳樂(lè)

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

烏蕨（Odontosoria chinensis）又稱烏韭、苦黃連、大葉金花草等，為陵齒蕨科，屬多年生草本植物[1]，烏蕨在我國(guó)的蘊(yùn)藏量極大，主要分布于長(zhǎng)江流域附近的江西、安徽、湖南、四川、云南、廣西等省。烏蕨具有保肝、清熱解毒、抗炎、抗腫瘤等作用[2～3]，《江西草藥》《中藥大辭典》《貴州中草藥名錄》《廣西中藥志》等都記載了烏蕨可用來(lái)治療痢疾、燙傷、支氣管炎、肝炎、黃疸等疾病[4]。烏蕨尚無(wú)明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，段萍等研究烏蕨地上部分質(zhì)量控制方法，對(duì)多批次烏蕨藥材的原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷含量進(jìn)行了測(cè)定[5]。本課題組前期對(duì)烏蕨的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行了總結(jié)[6]，同時(shí)對(duì)烏蕨抗炎活性部位進(jìn)行了研究[7]。目前，超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)[8～12]已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)成分的快速識(shí)別中，本實(shí)驗(yàn)利用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)快速識(shí)別烏蕨中化學(xué)成分，建立其化學(xué)成分分析方法，為烏蕨物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 AB-Sciex5600 系列LC/MSTrap 型質(zhì)譜儀，Waters C18色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），PeakView 1.2 軟件；對(duì)照品：原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906）、原兒茶醛（批號(hào)：110810-201608）、秦皮乙素（批號(hào)：741-200105）、香草酸（批號(hào)：776-9001）、咖啡酸（批號(hào)：885-200102）、牡荊苷（批號(hào) ：111687-201704）、 木 犀 草 苷 （ 批 號(hào) ：111720-201106）、槲皮苷（批號(hào)：111538-200302）、木犀草素（批號(hào)：110861-201611）、芹菜素（批號(hào)：111901-201102），以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均≥95%。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸溶液，柱溫為 40℃，進(jìn)樣量為 2 μl，流速為 0.25 ml/min。梯度洗脫條件見(jiàn)表1，質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表1 梯度洗脫條件

表2 質(zhì)譜條件

1.2.2 供試品和對(duì)照品溶液的制備 取粉碎后的烏蕨藥材0.5 g，加入純甲醇25 ml，超聲提取，過(guò)濾并定容于25 ml 棕色容量瓶中，用孔徑0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾即得供試品溶液。精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛、秦皮乙素等對(duì)照品各0.1 mg，用甲醇溶解定容于25 ml 棕色容量瓶中，用孔徑0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾即得對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 成分鑒定 通過(guò)整理各化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜信息，并結(jié)合對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行了確認(rèn)。見(jiàn)表3。用UPLC-Q-TOF-MS 對(duì)供試品及對(duì)照品進(jìn)行分析，正、負(fù)離子模式TIC 圖。見(jiàn)圖1。

圖1 正、負(fù)離子模式TIC 圖

表3 烏蕨醇提物化學(xué)成分

2.2 根據(jù)質(zhì)譜裂解特征鑒定的成分

2.2.1 有機(jī)酸類 該類化合物在負(fù)離子模式下主要以[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰形式存在，在高能碰撞下易發(fā)生CO、CO2、H2O 等中性分子丟失；有機(jī)酸苷則是先脫去相應(yīng)的糖，緊接著脫去CO、CO2等中性分子，文獻(xiàn)6 也表明烏蕨中含有原兒茶酸、原兒茶醛、龍膽酸、香草酸、2-O-β-D-（6-O-龍膽酰吡喃葡萄糖）龍膽酸等化合物。原兒茶酸保留時(shí)間（tR）為3.869 min，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 153[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C7H6O4，二級(jí)圖譜中通過(guò)脫去 CO2、HCO2分別產(chǎn)生 m/z 109[M-H-CO2]-，m/z108 [M-H-HCO2]-的碎片離子峰，與對(duì)照品及文獻(xiàn)9 比對(duì)，鑒定為原兒茶酸。原兒茶酸葡萄糖苷tR為3.508 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 315[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C13H16O9，二級(jí)圖譜中通過(guò)葡萄糖，產(chǎn)生m/z 153 [M-H-glc]-碎片離子峰，然后脫去CO2、HCO2分 別 產(chǎn) 生 m/z 109 [M-H-glc-CO2]-，m/z 108[M-H-glc-HCO2]-的碎片離子峰，與文獻(xiàn)8 比對(duì)，鑒定為原兒茶酸葡萄糖苷。2-O-β-D-（6-O-龍膽酰吡喃葡萄糖）龍膽酸t(yī)R為9.300 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 451 [M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C20H20O12，二級(jí)圖譜中，發(fā)生酚苷鍵斷裂，脫去龍膽酸的中性分子，生成m/z 297[M-H-C7H6O4]-碎片離子；再發(fā)生酯苷鍵斷裂，脫去糖環(huán)殘基，生成龍膽酸的特征離子m/z 153[M-H-C7H6O4-C6H8O4]-，脫去 CO2，生成 m/z 109[M-H-C7H6O4-C6H8O4-CO2]-的碎片離子。鑒定為2-O-β-D-（6-O-龍膽酰吡喃葡萄糖）龍膽酸。見(jiàn)圖2。

圖2 原兒茶酸、原兒茶酸葡萄糖苷、2-O-β-D-（6-O-龍膽酰葡萄糖）龍膽酸MS2 圖

2.2.2 香豆素類 該類化合物負(fù)離子模式下主要以[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰形式存在，發(fā)生裂解時(shí)出現(xiàn)連續(xù)脫去CO、CO2的碎片離子峰，如果是香豆素苷類成分，則首先脫去糖基部分。秦皮乙素tR為6.655 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 177[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C9H6O4，二級(jí)圖譜中脫去一分子CO、CO2生成m/z 149[M-H-CO]-，m/z 133[M-H-CO2]-碎片離子，再脫去一分子CO 生成m/z 105[M-H-CO2-CO]-碎片離子。與對(duì)照品及文獻(xiàn)10 比對(duì)鑒定為秦皮乙素。秦皮甲素tR為5.016 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 339[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C15H16O9，二級(jí)圖譜中脫去糖基部分，生成秦皮乙素苷元離子，m/z 177[M-H-glc]-。與文獻(xiàn)10 比對(duì)鑒定為秦皮甲素。見(jiàn)圖3。

圖3 秦皮乙素、秦皮甲素MS2 圖

2.2.3 黃酮碳苷 黃酮碳苷在負(fù)離子模式下，不首先出現(xiàn)脫糖的離子碎片，而是發(fā)生糖環(huán)裂解，產(chǎn)生丟失90 u、120 u、150 u 的離子碎片；在正離子模式下，會(huì)產(chǎn)生連續(xù)脫去水分子的碎片離子，文獻(xiàn)6 表明烏蕨中含有牡荊苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷等黃酮碳苷類化合物。牡荊苷tR為11.763 min，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 431[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C21H20O10，發(fā)生糖環(huán)裂解，產(chǎn)生m/z 341[M-H-90]-，m/z 311[M-H-120]-的特征碎片離子，脫去CO 產(chǎn)生m/z 283[M-H-120-CO]-的碎片離子；在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 433[M+H]+，二級(jí)圖譜中連續(xù)脫去3 個(gè)水分子生成m/z 415 [M+H-H2O]+，m/z 397 [M+H-2H2O]+，m/z 379[M+H-3H2O]+的碎片離子；發(fā)生糖環(huán)裂解，生成m/z 313[M+H-120]+，m/z 283[M+H-150]+的碎片離子。與對(duì)照品及文獻(xiàn)13、14 比對(duì)，鑒定為牡荊苷。葒草苷tR為11.443 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 447 [M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C21H20O11，發(fā)生糖環(huán)裂解，產(chǎn)生m/z 357[M-H-90]-，m/z 327[M-H-120]-，m/z 297[M-H-150]-的碎片離子峰；在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 449[M+H]+，連續(xù)脫去 3 個(gè)水分子后生成 m/z431[M+H-H2O]+，m/z 413 [M+H-2H2O]+，m/z 395[M+H-3H2O]+的碎片離子；發(fā)生糖環(huán)裂解，生成m/z 329[M+H-120]+，m/z 299[M+H-150]+的碎片離子。與文獻(xiàn)13、14 比對(duì)，鑒定為葒草苷。牡荊素鼠李糖苷tR為13.343 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 577 [M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C27H30O14，發(fā)生糖環(huán)裂解，產(chǎn)生 m/z 457[M-H-120]-碎片離子，脫去鼠李糖基，產(chǎn)生m/z 311[M-H-120-rha]-碎片離子；在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 579[M+H]+，二級(jí)圖譜中脫去鼠李糖，生成m/z 433[M+H-rha]+碎片離子，其后面裂解過(guò)程同牡荊苷。與文獻(xiàn)8 比對(duì)，鑒定為牡荊素鼠李糖苷。見(jiàn)圖4～圖5。

圖4 牡荊苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷在負(fù)離子模式下的MS2 圖

圖5 牡荊苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷在正離子模式下的MS2 圖

2.2.4 黃酮氧苷 該類化合物負(fù)離子模式下主要以[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰形式存在，發(fā)生裂解時(shí)主要脫去其糖基部分，生成其苷元離子，然后發(fā)生脫羰基或發(fā)生RDA 裂解，文獻(xiàn)6 表明烏蕨中含有芹菜素、山萘酚、芹菜素-7-O-葡萄糖苷等黃酮類化合物。芹菜素-7-O-葡萄糖苷tR為15.875 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 431[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C21H20O10，脫去葡萄糖，產(chǎn)生m/z 269[M-H-glc]-碎片離子，與文獻(xiàn)12 比對(duì)鑒定為芹菜素-7-O-葡萄糖苷。芹菜素tR為28.017 min，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 269[M-H]-，根據(jù)元素組成分析，分子式為C15H10O5，發(fā)生RDA 裂解，產(chǎn)生m/z 117，m/z 151 碎片離子，與對(duì)照品及文獻(xiàn)12 比對(duì)鑒定為芹菜素。

圖7 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素的MS2 圖

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)烏蕨甲醇提取物進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析共推斷出32 種化合物，其中有15 個(gè)有機(jī)酸類、2 個(gè)香豆素類、15 個(gè)黃酮類物質(zhì)（包括2 個(gè)黃酮苷元、7 個(gè)黃酮碳苷、6 個(gè)黃酮氧苷），原兒茶酸葡萄糖苷、咖啡酰葡萄糖苷為首次從烏蕨中發(fā)現(xiàn)。

目前文獻(xiàn)報(bào)道烏蕨含有的黃酮碳苷為單糖碳苷、二糖碳苷，二糖碳苷的碎裂規(guī)律鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，其與雙糖碳苷的裂解規(guī)律差異也尚不明確[13～14]，其主要問(wèn)題在于糖是與苷元連接還是與糖基連接，本文中的二糖碳苷及三糖碳苷有待進(jìn)一步深入研究。文獻(xiàn)[15～16]也表明有機(jī)酸、黃酮碳苷類成分與其抗炎、保肝等功效有關(guān)，因此有機(jī)酸、黃酮及其苷類成分是烏蕨的有效成分群，而烏蕨的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究有待進(jìn)一步深入挖掘。