李濤，王盼梁，袁梓博，火鐘坤，史冀華，李捷

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，河南 鄭州 450052；2.河南省消化器官移植重點實驗室，河南 鄭州 450052；3.鄭州市器官移植技術(shù)與應(yīng)用工程重點實驗室，河南 鄭州 450052)

肝細(xì)胞癌是全球第六大常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。全球每年約有84萬新增肝細(xì)胞癌病例，肝細(xì)胞癌患者死亡率約為70%，總體的5 a生存率約為10.1%[2]，盡管近幾年肝細(xì)胞癌的診斷和治療已取得很大突破，但患者總體預(yù)后依然較差，因此，尋找與肝細(xì)胞癌診斷相關(guān)的特異性靶點、提高患者總生存率非常重要。著絲粒蛋白F(centromere protein F，CENPF)基因位于染色體1q41上，作為著絲粒蛋白家族的成員之一，其是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的核抗原，在多種惡性腫瘤中高表達[3-4]，可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。國內(nèi)關(guān)于CENPF基因與肝細(xì)胞癌患者臨床特征相關(guān)性和基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)方面的報道較少，本研究擬利用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫分析CENPF基因與肝細(xì)胞癌患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性，并通過GSEA探尋高表達CENPF基因的肝細(xì)胞癌組織所富集的基因集，探討CENPF基因在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料收集從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載369例肝細(xì)胞癌組織樣本和50例癌旁組織樣本CENPF基因表達數(shù)據(jù)，獲取369例肝細(xì)胞癌組織樣本對應(yīng)的臨床資料和術(shù)后隨訪資料，剔除所需資料不全的病例，最終得到240例資料完整的肝細(xì)胞癌病例。

1.2 數(shù)據(jù)分類及相關(guān)性分析對上述臨床資料和術(shù)后隨訪資料進行整理，包括年齡、性別、病理學(xué)分級、肝細(xì)胞癌危險因素(病毒性肝炎、飲酒、吸煙)、TNM分期、血管侵犯、血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平、生存狀態(tài)和總生存期等。將癌組織中CENPF基因表達量由高到低進行排序，依據(jù)CENPF基因中位表達量746.5分為高表達組(≥746.5，120例)和低表達組(<746.5，120例)。分析兩組CENPF基因表達水平與肝細(xì)胞癌患者臨床資料及預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 GSEA根據(jù)CENPF基因表達量分為兩組，通過GSEA 4.1.0分析CENPF基因表達水平對各種生物通路基因集的影響，按照默認(rèn)富集加權(quán)統(tǒng)計方法，選擇MSigDB數(shù)據(jù)庫的基因集(c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt)作為參照基因集，置換次數(shù)為1 000次，計算基因富集得分(enrichment score，ES)，預(yù)測CENPF基因在肝細(xì)胞癌中可能的作用機制。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用edgeR軟件包計算基因表達水平，采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25，P75)]表示CENPF基因在肝細(xì)胞癌組織樣本中的表達水平，采用χ2檢驗分析基因表達水平與患者臨床特征的相關(guān)性，采用單因素和多因素Cox回歸分析研究患者臨床特征和CENPF基因表達水平與預(yù)后的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在GSEA分析中，以P<0.05以及錯誤率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.25的基因集為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1CENPF表達情況肝細(xì)胞癌組織中CENPF基因表達水平[1 614.0(1 071.0，2 422.0)]高于癌旁組織[306.0(201.5，473.0)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=13.219，P=0.001)。

2.2CENPF表達水平與肝細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系肝細(xì)胞癌組織中CENPF基因表達水平與病理學(xué)分級、血清AFP水平有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、血管侵犯、TNM分期、肝細(xì)胞癌危險因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 CENPF基因表達水平與肝細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3 肝細(xì)胞癌臨床特征和CENPF表達水平與預(yù)后的關(guān)系單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，血管侵犯、病理學(xué)分級、TNM分期、血清AFP水平、CENPF基因表達水平是肝細(xì)胞癌患者死亡的危險因素。將上述指標(biāo)納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示TNM分期、血管侵犯和CENPF基因表達水平是肝細(xì)胞癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)。見表2、3。

表2 CENPF基因表達水平與預(yù)后關(guān)系的單因素Cox回歸分析

2.4CENPF高表達組的GSEACENPF基因高表達的腫瘤樣本富集了與DNA復(fù)制(圖1A)、剪接體(圖1B)、細(xì)胞周期(圖1C)、同源重組(圖1D)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解(圖1E)、錯配修復(fù)(圖1F)相關(guān)的基因集，此外還富集了RNA降解、基底轉(zhuǎn)錄因子、堿基切除修復(fù)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等相關(guān)的基因集。

表3 CENPF基因表達水平與預(yù)后關(guān)系的多因素Cox回歸分析

A.DNA復(fù)制(P<0.001，F(xiàn)DR<0.001，ES=0.86)；B.剪接體(P<0.001，F(xiàn)DR<0.001，ES=0.78)；C.細(xì)胞周期(P<0.001，F(xiàn)DR<0.001，ES=0.77)；D.同源重組(P<0.001，F(xiàn)DR<0.001，ES=0.82)；E.泛素介導(dǎo)的蛋白水解(P<0.001，F(xiàn)DR<0.001，ES=0.72)；F.錯配修復(fù)(P<0.001，F(xiàn)DR<0.001，ES=0.80)。

3 討論

大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者均有慢性肝損傷病史，以肝硬化最常見，其他常見誘因包括病毒性肝炎、飲酒、代謝紊亂等[5]。由于大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者早期無明顯臨床癥狀，初次就診時常常已進展至中晚期，只有少數(shù)患者能接受手術(shù)治療，手術(shù)方式包括肝切除、原位肝移植、射頻消融等[6]。盡管近年來臨床診療技術(shù)突飛猛進，靶向藥物層出不窮，但肝細(xì)胞癌患者總體預(yù)后仍較差。研究肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展可能的分子機制，尋找有助于判斷肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的標(biāo)志物和治療靶點，具有重要意義。

CENPF是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，依賴細(xì)胞周期進行表達，在整個細(xì)胞周期的G2和M期表達量達到峰值，并在有絲分裂結(jié)束時完成降解[7]。在小鼠胚胎的發(fā)育中，CENPF被抑制和法尼基化將影響胚胎的發(fā)育，提示CENPF在部分遺傳和受精卵發(fā)育中發(fā)揮著非常重要的作用[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CENPF可通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、葡萄糖代謝和表觀遺傳調(diào)控促使前列腺癌的發(fā)生[7]。CENPF在肺腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且其高表達與肺腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[9]。此外，有研究者通過基因組圖譜分析了胰腺癌及癌旁組織中CENPF的表達量，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中CENPF表達量明顯升高，敲低CENPF基因，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞系中CENPF基因沉默可抑制細(xì)胞的生長和集落的形成，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期[3]。綜上，CENPF高表達可促進多種惡性腫瘤的發(fā)生，可能是一個有效的腫瘤預(yù)測指標(biāo)和治療靶點。

本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫資料，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中CENPF基因表達水平高于癌旁組織，提示CENPF基因的高表達可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。CENPF基因的高表達與病理學(xué)分級、血清AFP水平有關(guān)，而不受年齡、性別、血管侵犯、TNM分期、肝細(xì)胞癌危險因素的影響。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，血管侵犯、TNM分期、CENPF基因表達水平是肝細(xì)胞癌患者死亡的獨立危險因素，與樊斌等[11]利用GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)血管侵犯也是肝細(xì)胞癌患者死亡的獨立危險因素。明確了CENPF基因與肝細(xì)胞癌患者臨床特征的相關(guān)性后，本研究進一步對CENPF促進肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的可能機制進行了初步探索。GSEA結(jié)果顯示，CENPF基因高表達的腫瘤樣本富集了與DNA復(fù)制、剪接體、細(xì)胞周期、同源重組、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、錯配修復(fù)相關(guān)的基因集，此外還富集了RNA降解、基底轉(zhuǎn)錄因子、堿基切除修復(fù)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等相關(guān)的基因集。目前對于上述基因集在肝細(xì)胞癌中表達情況的研究較少，因此CENPF的具體作用機制有待進一步研究證實。

綜上所述，CENPF基因高表達是肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素之一，對肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有不利影響，有望成為肝細(xì)胞癌早期診斷及評估預(yù)后的指標(biāo)之一，這為未來基礎(chǔ)和臨床研究提供了一個新方向。CENPF基因高表達癌組織中富集的信號通路和基因集是否可用于預(yù)測肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，尚需大量研究驗證。