唐元瑜,劉海琴,馬華根

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院金匱教研室，北京100029）

主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（aortic endothelial cells，AECs）為覆蓋于主動(dòng)脈內(nèi)膜表面的單層扁平上皮細(xì)胞，是血管壁與血液之間的分界細(xì)胞和形成心血管封閉管道系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在調(diào)控組織與血液的物質(zhì)交換、維持血液的流動(dòng)性、調(diào)節(jié)血管平滑肌功能和抑制血管壁細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮著重要作用［1-2］。AECs的形態(tài)、功能和生理特性與外界溫度、濕度、壓強(qiáng)等環(huán)境因素以及體內(nèi)鹽、脂、糖的攝入量有密切關(guān)聯(lián)，是研究高溫、高濕和高壓等特殊環(huán)境［3-4］以及高鹽、高脂、高糖飲食下［5-7］造成血管功能穩(wěn)態(tài)失衡和內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制的實(shí)用工具細(xì)胞。目前，國內(nèi)外報(bào)道的大鼠AECs原代培養(yǎng)方法主要有酶消化法［8-10］和組織塊法［11-13］，其中后者雖然實(shí)驗(yàn)成本低，但存在原代培養(yǎng)周期長、易受雜細(xì)胞污染等不足。本課題組積極改進(jìn)以往組織塊培養(yǎng)方法，首次采用內(nèi)膜外翻切段貼壁培養(yǎng)法，將主動(dòng)脈內(nèi)膜外翻，通過切段加速固化小血管組織促進(jìn)內(nèi)膜貼壁、縮短原代AECs培養(yǎng)周期，以期建立一種簡便、高效且實(shí)用的大鼠AECs原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器100 g SD雄性大鼠1只，購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（閩）2016-0002。L型-谷氨酰胺（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），肝素鈉（南京新百藥業(yè)有限公司），胰島素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（南京凱基生物技術(shù)有限公司），M 199培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司），SABC即用型兔IgG-免疫組織化學(xué)試劑盒、4%多聚甲醛、兔抗鼠第Ⅷ因子（factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ）抗體和DAB顯色劑均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。Airtech超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），TDZ4AWS低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），Leica-DFC295倒置生物顯微鏡（德國Leica公司），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2 目的細(xì)胞原代培養(yǎng)將大鼠頸椎脫臼處死后斷頭，用75%乙醇浸泡消毒5 min。無菌條件下，逐層剪開胸腹腔，充分暴露主動(dòng)脈，沿著脊柱分離主動(dòng)脈到髂總動(dòng)脈分支處。取出主動(dòng)脈，無菌PBS緩沖液沖洗2～3次，清除表面殘留血漬，并進(jìn)一步剝除主動(dòng)脈外周的結(jié)締組織和脂肪；PBS緩沖液沖洗2～3次，在無菌玻璃皿中將主動(dòng)脈管腔外翻，使內(nèi)膜暴露于外。PBS緩沖液沖洗2～3次，將主動(dòng)脈切成長為1.0～1.5 mm的血管段后，均勻接種于培養(yǎng)瓶中，瓶底朝上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中固化45～60 min。豎立瓶身，添加2～3 mL M 199完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，4 mmol·L－1L型谷氨酰胺，20 mmol·L－1HEPES，100 mg·L－1肝素鈉，1 000 U·L－1胰島素），以覆蓋組織塊為度，小心平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。7 d后將血管組織挑除，并全量更換新鮮培養(yǎng)液，其后每隔2～3 d半量換液1次，待細(xì)胞融合成片，即可傳代培養(yǎng)。

1.3 目的細(xì)胞傳代培養(yǎng)待原代細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用玻璃探針鏡下刮除單獨(dú)成團(tuán)的成纖維樣細(xì)胞。吸棄原培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS緩沖液漂洗2次，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合酶消化液4 mL于室溫下消化2～3 min，并輕微地間斷性敲擊振搖培養(yǎng)瓶底部，以促進(jìn)細(xì)胞脫落。鏡下觀察到大部分內(nèi)皮樣細(xì)胞收縮變圓，開始脫壁時(shí)，立即加入4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，將其移入離心管中進(jìn)行離心；棄上清液，將細(xì)胞沉淀與6 mL培養(yǎng)液吹打混勻制成細(xì)胞懸液后，以1∶2的傳代比例接種，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)觀察于倒置顯微鏡下觀察原代和第1代目的細(xì)胞的形態(tài)、密度及融合度等生長狀況，并拍照記錄。

1.5FⅧ相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色當(dāng)?shù)?代目的細(xì)胞貼壁生長，融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行鑒定。PBS緩沖液漂洗3次，濾紙吸干殘存液；滴加4%多聚甲醛，以覆蓋細(xì)胞表面為度，常溫固定15 min后，PBS緩沖液漂洗3次；滴加0.3%Triton X-100，常溫透膜15 min后，PBS緩沖液漂洗3次；滴加5%BSA，封閉20 min，甩棄封閉液；滴加1∶250稀釋的兔抗人FⅧ多克隆抗體，蓋上封口膜，置于濕盒中4℃孵化過夜；甩棄一抗，PBS緩沖液漂洗3次；滴加羊抗兔IgG抗體，在37℃恒溫箱中孵化30 min，甩棄二抗，PBS緩沖液漂洗3次；滴加SABC，繼續(xù)孵化20 min，PBS緩沖液漂洗3次；加入DAB染色劑，室溫染色1～2 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，至胞漿呈棕紅色即可。

2 結(jié) 果

2.1 原代細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)血管段接種3 d后，有少量細(xì)胞從貼壁組織邊緣爬出并逐漸向外生長延伸，遷移速度較慢，單個(gè)細(xì)胞呈短梭形或多角形。培養(yǎng)5 d后細(xì)胞遷移速度加快，生長旺盛，逐漸融合成片，局部開始出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。培養(yǎng)10～12 d時(shí)，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面，呈典型的單層、鋪路石樣鑲嵌式排列。見圖1。

圖1 培養(yǎng)不同時(shí)間后原代細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)Fig.1Morphology of primary cells after cultured for different time

2.2 傳代細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和FⅧ免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果第1代傳代細(xì)胞接種24 h后，可見到短梭形或多角形的內(nèi)皮樣細(xì)胞均勻散在分布；3～4 d后細(xì)胞集落相互融合，并呈典型的單層、鋪路石樣鑲嵌式排列。FⅧ免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：胞核和胞質(zhì)淡染，呈現(xiàn)棕紅色，F(xiàn)Ⅷ表達(dá)為陽性，陽性細(xì)胞率達(dá)98%以上。見圖2。

圖2 傳代細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和FⅧ免疫細(xì)胞化學(xué)染色Fig.2Morphology of passage cells and FⅧimmunocytochemistry staining

3 討 論

大鼠是原代AECs培養(yǎng)中最常用的取材動(dòng)物［14］，但因其主動(dòng)脈管徑細(xì)小、分支多且與脊柱相貼而不易分離，同時(shí)AECs的增殖生長速度相對(duì)緩慢，培養(yǎng)過程中容易受到平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞污染［15］，從而導(dǎo)致大鼠AECs的體外分離培養(yǎng)存在操作難度大、細(xì)胞獲得少和純度低等問題。因此，建立一種簡便高效、重復(fù)性好的大鼠AECs原代培養(yǎng)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，采用化學(xué)酶消化法培養(yǎng)原代大鼠AECs，存在操作步驟繁瑣、消化時(shí)間難以把握、化學(xué)損傷較大和細(xì)胞產(chǎn)量低下等問題［16］；而組織塊法則因其實(shí)驗(yàn)流程簡單、操作時(shí)間短、培養(yǎng)成本低且成功率較高而受到更多研究者的青睞。在組織塊法培養(yǎng)中，多數(shù)學(xué)者強(qiáng)調(diào)主動(dòng)脈內(nèi)膜面要與培養(yǎng)瓶底面相貼［17-19］，并要減少外膜細(xì)胞污染。何珂帥等［20］從人主動(dòng)脈組織中鈍性分離出血管內(nèi)皮層，單獨(dú)加以消化過篩后接種培養(yǎng)，從而剔除了血管中外層組織，保障了內(nèi)皮細(xì)胞的純度。潘禮龍等［18］則將主動(dòng)脈內(nèi)膜外翻，并扎緊血管兩端后，用Ⅰ型膠原酶消化1 h，再切去血管兩末端，余下的血管切成小塊，按內(nèi)膜朝下貼入培養(yǎng)瓶，以此防止消化到血管外膜，僅單純松解內(nèi)膜組織，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞提早爬出。楊翠燕等［19］則將外翻的主動(dòng)脈兩端結(jié)扎燙烙后，不經(jīng)剪碎消化，將整根血管直接接種培養(yǎng)，從而避免了血管外膜細(xì)胞的污染以及剪碎消化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。本課題組前期研究結(jié)果提示：對(duì)于管徑細(xì)小的大鼠主動(dòng)脈而言，剝離血管內(nèi)皮層難度系數(shù)較大；血管兩端結(jié)扎法和燙烙法對(duì)細(xì)胞也有一定損傷，并增加了污染概率；整根血管接種則不利于組織貼壁，且培養(yǎng)出的原代細(xì)胞分布不均，局部容易提前出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。因此，本課題組在研究中將主動(dòng)脈管腔外翻后，將其切成長為1.0～1.5 mm的血管小段，并均勻接種于瓶底。此方法簡單易行，爬出的外膜成纖維細(xì)胞較少，且無需使用價(jià)格昂貴的膠原酶，避免了化學(xué)酶在消化過程中降低細(xì)胞活性，同時(shí)只需一根大鼠主動(dòng)脈即可滿足實(shí)驗(yàn)需求，從而大幅度減少了實(shí)驗(yàn)成本。

如何使血管組織牢固貼壁亦是組織塊法培養(yǎng)中的一大難點(diǎn)。林翠紅等［14］將無菌玻片蓋于血管段上方，并輕輕下壓，通過玻片的重力使組織塊與孔板間的接觸更加緊密；季政等［21］則用1%明膠提前包被培養(yǎng)瓶，借助電荷吸附力以利于組織貼壁；劉彥等［11］提出要控制培養(yǎng)液的添加量，避免組織塊懸浮，且接種后需絕對(duì)靜置培養(yǎng)2 d。本課題組多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：接種的血管段長度不宜超過1.5 mm，并在接種后將瓶底朝上放入培養(yǎng)箱中固化45～60 min，可有效使血管內(nèi)膜牢固貼附于瓶底；隨后加入培養(yǎng)液的量以覆蓋血管段為度；培養(yǎng)前2 d不挪動(dòng)培養(yǎng)瓶，以防止血管段漂浮。此外，細(xì)胞純化工作也是原代AECs培養(yǎng)后期的關(guān)鍵步驟。侯偉等［12］提出采用機(jī)械刮除法，借助細(xì)胞刮或玻璃探針刮除獨(dú)立成片的雜細(xì)胞；而宋明寶等［22］針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)化學(xué)酶的敏感度高于其他雜細(xì)胞和消化時(shí)脫壁較早的特性，采用差速消化法純化目的細(xì)胞。本課題組則根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞爬出的時(shí)間早于平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)［23-24］，在接種后的第7天挑除血管段，此時(shí)爬出的AECs較多而平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞尚未大量增殖，因而可有效減少雜細(xì)胞的污染；同時(shí)在傳代過程中，結(jié)合機(jī)械刮除法和差速消化法以進(jìn)一步純化目的細(xì)胞，最終FⅧ免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示培養(yǎng)出的AECs純度可達(dá)98%以上。

綜上所述，本研究在以往組織塊法培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行簡化改良，成功建立了一種簡便高效、細(xì)胞得率和純度高的大鼠AECs原代培養(yǎng)方法——內(nèi)膜外翻切段貼壁培養(yǎng)法，從而解決了AECs難獲取和難培養(yǎng)的問題，為進(jìn)一步探索AECs的分子生物學(xué)特性、開展心腦血管疾病研究提供了一種重要載體和工具細(xì)胞。