李化龍 王景紅 張維敏 柏秦鳳 張 燾 潘宇鷹 權(quán)文婷

(陜西省農(nóng)業(yè)遙感與經(jīng)濟作物氣象服務(wù)中心， 西安 710015)

引 言

獼猴桃為多年生落葉藤本植物，果實以其風味獨特、富含維生素C而被譽為“水果之王”[1]。2019年中國獼猴桃種植面積達2.9×105hm2，產(chǎn)量為3×106t，種植面積和產(chǎn)量均居世界第1位。近年種植區(qū)域不斷北擴南移，已發(fā)展到全國22個省份，其中陜西、四川、河南、湖南、貴州5省種植面積占全國85%以上，發(fā)展前景十分廣闊。

獼猴桃原生境多為山地林下半陰生環(huán)境，空氣濕潤，溫度變化緩和，弱光。由于商品化栽培歷史短、品種更新大部分直接來源于野生環(huán)境，氣候馴化不足，加之自身具有肉質(zhì)根系分布淺、葉片肥大、氣孔發(fā)達、蒸騰強烈的生理特點，決定了獼猴桃是一種抗逆性較弱的樹種，集約栽培在平原地區(qū)的農(nóng)田環(huán)境與其自然原生環(huán)境相差較大，農(nóng)田陽光直射環(huán)境下常使樹體溫度過高，造成葉片、果實、樹干傷害，影響獼猴桃的正常生長和開花結(jié)果，進而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。在氣候變暖背景下[2-5]，獼猴桃主產(chǎn)區(qū)夏季高溫天氣時有發(fā)生，甚至出現(xiàn)40℃以上的極端高溫天氣，獼猴桃高溫傷害尤為突出，葉片萎蔫、落葉、果實日灼、落果，甚至出現(xiàn)死樹的現(xiàn)象。2013年江、浙、滬、皖等地遭遇高溫災(zāi)害，35℃及以上天氣持續(xù)40 d 以上，中華獼猴桃果實及葉片均遭受高溫日灼傷害，葉片枯焦脫落，果實出現(xiàn)日灼病斑，嚴重減產(chǎn)；2016年立秋后，陜西省安康市出現(xiàn)50余天持續(xù)高溫天氣，最高氣溫達到42℃， 漢濱區(qū)恒口鎮(zhèn)三條嶺獼猴桃園落果率超過60%，50%植株整株死亡[6-8]。

近年來葉綠素快速熒光誘導(dǎo)動力學分析技術(shù)(JIP-test)已成為研究植物光合作用的有力工具，JIP-test的參數(shù)對環(huán)境脅迫尤其是高溫脅迫非常敏感[9-11]，可無損傷地敏感感知植物生理狀態(tài)與環(huán)境之間的關(guān)系，因此，JIP-test技術(shù)被稱為測定葉片光合功能快速、無損傷的探針。Georgieva等[12]利用葉綠素熒光特性研究高溫對豌豆葉片的影響，認為在45℃高溫脅迫條件下表現(xiàn)出光合作用效率下降、光合電子傳遞受阻，嚴重高溫脅迫還會造成放氧復(fù)合體、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)供體側(cè)和受體側(cè)的傷害，尤其是對放氧復(fù)合體的傷害更為明顯，導(dǎo)致葉綠素快速熒光誘導(dǎo)動力學(OJIP)曲線K相(照光后300 μs 處的特征位點)熒光出現(xiàn)顯著增加；王振興等[13]對軟棗獼猴桃研究認為，JIP-test測定的相關(guān)參數(shù)能有效評價不同溫度對軟棗獼猴桃光系統(tǒng)活性的影響，其葉片最大光化學效率在35～48℃的范圍內(nèi)變化不明顯，溫度超過52℃時顯著下降；鐘敏等[14]探討高溫環(huán)境下葉綠素熒光特性的日變化，認為獼猴桃葉片中PSⅡ反應(yīng)中心對高溫較為敏感，且較易被高溫損傷；杜國棟等[15]通過設(shè)置不同高溫環(huán)境對仁用杏葉片PSⅡ光化學活性進行研究，認為高溫損害PSⅡ供體側(cè)和受體側(cè)的功能，造成光合效率下降，是對葉片光合機構(gòu)傷害的主要機制之一。迄今為止，從葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學方面研究夏季高溫脅迫對獼猴桃葉片光合功能影響的報道很少, 其相關(guān)熒光參數(shù)若能用于農(nóng)作物熱害程度識別，對農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害預(yù)測預(yù)警、災(zāi)害防御和評估具有重要意義[16-17]。本研究采取恒定高溫脅迫處理方式對獼猴桃葉片進行高溫模擬試驗，利用JIP-test分析方法[18-21]，分析不同程度高溫脅迫對獼猴桃葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響，揭示獼猴桃葉片葉綠素對溫度脅迫的反應(yīng)特征，建立獼猴桃高溫熱害的識別指標，為獼猴桃氣象災(zāi)害預(yù)測、預(yù)警、防御和評估方法等提供技術(shù)支持[22-24]。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

試驗于2020年8月中下旬在陜西省周至縣西安佰瑞獼猴桃研究院獼猴桃園(34.1°N，108.5°E，海拔457 m)進行，屬秦嶺北麓陜西獼猴桃主產(chǎn)區(qū)，該區(qū)是全球獼猴桃的最佳適宜生長區(qū)之一，獼猴桃種植面積達2.8×104hm2，年產(chǎn)獼猴桃鮮果為4.9×105t[25]。試驗區(qū)年平均氣溫為13.2℃，最熱月平均氣溫為26.1℃，極端最高氣溫為42.2℃，地面極端最高溫度為69.2℃，年平均降水量為660 mm，屬暖溫帶季風氣候，以美味系獼猴桃為主要栽培品種。

1.2 試驗設(shè)計

試驗材料為樹齡10年的美味系獼猴桃，品種為徐香，株行距為3 m×4 m,大棚架型栽培，中壤土，噴灌條件良好。

試驗采用Yaxin-1162連續(xù)激發(fā)式葉綠素熒光儀測定葉綠素快速熒光誘導(dǎo)動力學曲線。

設(shè)置30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃，50℃，52℃，54℃共10個溫度梯度，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h共6個時間梯度，其中30～48℃各處理的脅迫持續(xù)時間為0.5～3.0 h，50～54℃為1.0 h，以20～25℃環(huán)境溫度下的測值為對照。脅迫溫度由RR-CTC102C恒溫控制箱實現(xiàn)。

選擇葉片功能正常的一年生結(jié)果枝置于RR-CTC102C恒溫箱內(nèi)，葉綠素熒光儀探頭由葉夾固定于箱內(nèi)葉片上，分別于升溫前(0.0 h)、達到設(shè)定溫度后0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h各測定一次葉片葉綠素熒光。0.0 h處理測定前用遮光葉夾對獼猴桃葉片進行暗適應(yīng)20 min。葉片在葉綠素熒光儀飽和脈沖光(2000 μmol·m-2·s-1)中暴露1 s后,測得0.01～1000 ms范圍的完整葉綠素快速熒光誘導(dǎo)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析與計算方法

參考Strasser等[19-20]的JIP-test計算方法，參考文獻[26],本文由葉綠素快速熒光誘導(dǎo)曲線得到葉綠素熒光參數(shù),見表1。

為比較不同溫度處理下葉綠素熒光的差異，將不同時段內(nèi)葉綠素熒光標準化為相對可變熒光[27-28]，并計算各溫度處理與對照的熒光差異。

對0.01～1000 ms:

Vt=(Ft-FO)/(Fm-FO)，

ΔVt=Vts-Vtc；

(1)

對0.01～2 ms:

Wt=(Ft-FO)/(FJ-FO)，

ΔWt=Wts-Wtc。

(2)

其中，F(xiàn)J為2 ms處的瞬時熒光強度；Fm為最大熒光強度；Ft表示t時刻熒光強度；Vt，Wt表示t時刻對應(yīng)的相對可變熒光強度；Vts，Wts為不同溫度脅迫下的相對熒光強度；Vtc，Wtc為常溫條件下的相對熒光強度。

表1 快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線(OJIP)分析中使用的術(shù)語和公式Table 1 Formulae and terms used in the analysis of OJIP fluorescence induction dynamics curve

2 結(jié)果與分析

2.1 不同高溫脅迫下獼猴桃葉片OJIP曲線特征

2.1.1 高溫脅迫對獼猴桃葉片OJIP曲線影響

不同溫度處理后獼猴桃葉片的OJIP曲線形態(tài)變化顯著(圖1)。30℃，33℃(趨勢相同，圖略)及36℃溫度脅迫下各處理與對照(0.0 h)的OJIP曲線形態(tài)無明顯差異，曲線形狀具有典型的OJIP曲線特征，表明PSⅡ尚未受到明顯的高溫傷害(圖1)。脅迫溫度升高至39℃，對照與處理之間的OJIP曲線形態(tài)開始發(fā)生顯著變化：O相(照光后20 μs處的特征位點)在高溫脅迫下較對照開始升高，P相(最大熒光時刻)較對照開始下降，曲線中J～I段趨于平緩。特別是在48℃溫度脅迫下，J相(照光后2 ms 處的特征位點)、I相(照光后30 ms處的特征位點)拐點消失，曲線趨于變直，48℃持續(xù)時間3.0 h處理，J，I，P相均消失，表明光合電子傳遞過程嚴重受阻。高溫脅迫0.5～3.0 h各處理之間的OJIP曲線差異不明顯(圖略)，表明獼猴桃葉片高溫受害可能在0.0～0.5 h內(nèi)已經(jīng)發(fā)生。

圖1 不同高溫脅迫下獼猴桃葉片快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線Fig.1 The fast chlorophyll fluorescence induction dynamics curve of kiwifruit leaves under different high temperature stress conditions

續(xù)圖1

2.1.2 高溫脅迫對獼猴桃葉片ΔVt影響

通過比較高溫脅迫與對照相對可變熒光強度差值ΔVt發(fā)現(xiàn)(圖2，3.0 h處理)，高溫脅迫顯著增加獼猴桃葉片葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線中K相和J相的相對可變熒光VK和VJ。VJ增加通常反映PSⅡ 受體側(cè)的電子傳遞受到高溫損傷[15]，ΔVJ值越大表示電子傳遞效率越低，表明高溫脅迫使初級醌受體(QA)向次級醌受體(QB)的電子傳遞受到抑制；VK增加說明高溫處理對光合機構(gòu)放氧復(fù)合體(oxygen-evolving complex，OEC)活性產(chǎn)生較大影響[27]。

在30℃，33℃，36℃處理下，ΔVK，ΔVJ均小于零，表明此時獼猴桃葉片PSⅡ的受體側(cè)和OEC尚未受到傷害(圖2)；從39℃處理開始，在300 μs左右和2 ms左右特征位點處的葉綠素熒光產(chǎn)量開始增加(圖2)，表明PSⅡ受體側(cè)和OEC開始受到傷害；隨脅迫溫度升高，ΔVK，ΔVJ的正向增幅加大，48℃溫度脅迫下，不僅ΔVK，ΔVJ達到最大，不同持續(xù)時間處理之間的差異也開始顯現(xiàn)。

圖2 高溫脅迫對獼猴桃葉片ΔVt影響(ΔVK，ΔVJ和ΔVI為分別在300 μs，2 ms和30 ms處測定的ΔVt)Fig.2 Effects of high temperature stress on the relative variable fluorescence(ΔVt) for kiwifruit leaves (ΔVK，ΔVJ and ΔVI represent the relative variable fluorescence at t=300 μs，2 ms，30 ms，respectively)

續(xù)圖2

2.1.3 高溫脅迫對獼猴桃葉片ΔWt影響

用(FJ-FO)對可變熒光進行標準化，得到相對可變熒光變化曲線Wt(圖3，3.0 h處理)，Wt為K相可變熒光占(FJ-FO)振幅的比例，反映PSⅡ放氧復(fù)合物的活性，其值隨供體側(cè)傷害程度的增加而增加[29-30]，常用于表征OEC受傷害程度，通過比較ΔWt的大小，可以計算出OEC受傷害程度。

由圖3可知，在300 μs附近各處理與對照之間Wt出現(xiàn)最大差值，計為ΔWK。在30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃不同溫度脅迫下，各處理ΔWK均大于零，表明即使在30℃弱溫度脅迫下，獼猴桃葉片放氧復(fù)合體活性已經(jīng)受到不利影響。33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃溫度脅迫下各處理的ΔWK分別是30℃溫度脅迫下ΔWK的1.6，2.0，2.6，3.4，3.9，5.4倍，表明隨脅迫溫度升高，各處理ΔWK呈指數(shù)增大。

圖3 高溫脅迫對獼猴桃葉片Wt及ΔWt影響Fig.3 Effects of high temperature stress on the relative variable fluorescence Wt and ΔWt for kiwifruit leaves

續(xù)圖3

2.2 高溫脅迫對獼猴桃葉片F(xiàn)O，F(xiàn)m，F(xiàn)a影響

2.2.1 高溫脅迫對獼猴桃葉片初始熒光FO影響

FO是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放狀態(tài)時(經(jīng)過充分暗適應(yīng)以后)的初始熒光強度。在高溫脅迫下，植物體內(nèi)葉綠素類囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，首先反映為初始熒光FO的上升。FO增加量越多，類囊體膜受損程度就越嚴重。隨溫度升高，F(xiàn)O會在某一溫度臨界點突然上升[31]，表明反應(yīng)中心受到破壞，因此，F(xiàn)O是檢測熱脅迫作用的生理指標[32-35]。圖4表明30℃≤T<45℃時，獼猴桃葉片F(xiàn)O值隨溫度的增加和脅迫時間的延長變化不大；在45℃，F(xiàn)O熒光曲線出現(xiàn)突變臨界點，表明脅迫溫度大于45℃時，獼猴桃葉片葉綠素類囊體膜結(jié)構(gòu)開始發(fā)生改變，溫度脅迫使得PSⅡ反應(yīng)中心開始出現(xiàn)失活狀態(tài)。45℃≤T<50℃時，隨溫度升高FO呈明顯增加趨勢。50℃之后，F(xiàn)O基本維持高值。

圖4 高溫脅迫對獼猴桃葉片F(xiàn)O影響Fig.4 Effects of high temperature stress on FO of kiwifruit leaves

2.2.2 高溫脅迫對獼猴桃葉片F(xiàn)m影響

Fm是在飽和脈沖的強光照射下PSⅡ電子鏈上的電子由于迅速堆積而產(chǎn)生的最大熒光，表示PSⅡ接受光量子的最大能力，F(xiàn)m下降是熱耗散增加的標志。

Fm對溫度變化比較敏感，其隨溫度變化的趨勢表現(xiàn)出3個階段性特征(圖5)：30℃≤T<39℃時，F(xiàn)m隨溫度升高下降幅度較緩；39℃≤T<45℃時，F(xiàn)m隨溫度升高遞減幅度加大；45℃≤T≤54℃時，F(xiàn)m隨溫度升高降幅趨于平緩。

2.2.3 高溫脅迫對獼猴桃葉片F(xiàn)a影響

Fa表示PSⅡ最大光化學效率，反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)光能轉(zhuǎn)化效率，是植物發(fā)生光抑制的敏感指標[35]。獼猴桃葉片PSⅡ最大光化學效率Fa隨脅迫溫度升高呈S型下降趨勢(圖6)：30℃≤T<39℃條件下，F(xiàn)a隨脅迫溫度的升高和脅迫時間的增加無明顯變化，基本維持在0.8以上的正常值；39℃≤T<45℃時，F(xiàn)a隨溫度升高出現(xiàn)緩慢降低趨勢，遞減幅度0.02/℃，且隨脅迫時間的增加不同處理的曲線表現(xiàn)為散發(fā)狀態(tài)；45℃≤T<50℃時，隨脅迫溫度的升高Fa出現(xiàn)快速降低，遞減幅度達到0.11/℃，是39℃≤T<45℃減幅的5.5倍，且表現(xiàn)為隨脅迫時間延長降低幅度加大的趨勢；當脅迫溫度升高到50℃以上，F(xiàn)a達到最低值，并趨于穩(wěn)定。Fa隨脅迫溫度升高而下降表明葉片吸收的光能不能有效轉(zhuǎn)化為化學能，PSⅡ反應(yīng)中心出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象。

圖5 高溫脅迫對獼猴桃葉片F(xiàn)m影響Fig.5 Effects of high temperature stress on Fm of kiwifruit leaves

圖6 高溫脅迫對獼猴桃葉片F(xiàn)a影響Fig.6 Effects of high temperature stress on Fa of kiwifruit leaves

2.3 高溫脅迫對獼猴桃葉片單位面積能量流分配和反應(yīng)中心密度影響

植物的光合器官對光能的吸收、轉(zhuǎn)化和耗散等狀況可以由比活性更確切地反映[36]。獼猴桃葉片單位面積捕獲的光能(Tr)隨脅迫溫度升高表現(xiàn)為兩段性的變化特點(圖7)：30℃≤T<45℃時，Tr隨脅迫溫度升高表現(xiàn)為下降趨勢，脅迫溫度高于45℃后，Tr維持穩(wěn)定少變狀態(tài)。單位面積用于電子傳遞的光能(Et)隨脅迫溫度升高表現(xiàn)為三段性特征：30℃≤T<39℃時，各處理Et基本保持穩(wěn)定；39℃≤T<45℃時，各處理Et下降迅速；脅迫溫度高于45℃后，各處理Et隨溫度升高下降幅度減緩。單位面積用于熱耗散的能量(Dd)隨脅迫溫度的升高呈現(xiàn)為兩段性的變化特點：30℃≤T<45℃時，各處理Dd基本保持穩(wěn)定；當脅迫溫度超過45℃，各處理Dd隨溫度升高呈上揚趨勢，且隨脅迫時間的增加，Dd增加幅度顯現(xiàn)出較明顯的增加，表明脅迫溫度超過45℃，光破壞防御機制開始通過熱耗散消耗過剩光能。

單位面積活性反應(yīng)中心密度(Rm)對溫度脅迫響應(yīng)較敏感，在整個高溫控制試驗范圍內(nèi)(30℃≤T≤54℃)隨脅迫程度加強Rm直線減小，在45℃附近出現(xiàn)反應(yīng)中心半衰溫度點。溫度脅迫持續(xù)時間對Rm的失活影響不明顯(圖7)。

圖7 高溫脅迫對獼猴桃葉片Tr,Et,Dd,Rm影響Fig.7 Effects of high temperature stress on Tr,Et,Dd,Rm of kiwifruit leaves

3 結(jié)論與討論

綜合獼猴桃葉片各類葉綠素熒光參數(shù)對不同程度高溫脅迫的反應(yīng)，得出如下結(jié)論：

1) 30℃≤T<39℃時，Tr，Rm，ΔWK等熒光參數(shù)受到影響，F(xiàn)O，F(xiàn)m，F(xiàn)a，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et等熒光參數(shù)受影響較小，表明獼猴桃葉片PSⅡ在該溫度范圍發(fā)生輕微熱抑制，可認定為輕度脅迫溫度。

2) 39℃≤T<45℃時，除Tr，Rm，ΔWK等熒光參數(shù)受到影響外，F(xiàn)O，F(xiàn)m，F(xiàn)a，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et等熒光參數(shù)受溫度脅迫影響也出現(xiàn)劇烈變化，表明PSⅡ在該溫度范圍出現(xiàn)顯著熱抑制，可認定為中度脅迫溫度。

3)T≥45℃時，Tr，Rm，ΔWK，F(xiàn)O，F(xiàn)m，F(xiàn)a，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et等熒光參數(shù)均趨于峰值或降至谷值，表明PSⅡ在此溫度條件下發(fā)生嚴重熱傷害，這也與46℃經(jīng)3.0 h處理后獼猴桃葉片開始出現(xiàn)焦斑的形態(tài)表現(xiàn)相一致，可認定為重度脅迫溫度。

很多關(guān)于葉片高溫脅迫導(dǎo)致PSⅡ結(jié)構(gòu)和功能一系列變化甚至損害的結(jié)果表明:高溫脅迫傷害葉綠素熒光參數(shù)程度不盡相同[37-39],敏感位點在較低脅迫溫度下就開始表現(xiàn)出受傷害特征，次級敏感位點在較高脅迫溫度下才相繼受到傷害[40]。本研究的結(jié)果類似：對獼猴桃葉片，Tr，Rm，ΔWK在30℃≤T≤54℃時均受溫度脅迫影響，屬獼猴桃葉片光合機構(gòu)敏感位點參數(shù)；FO，F(xiàn)m，F(xiàn)a，ΔVK，ΔVJ，Dd，Et具有在低溫度脅迫下穩(wěn)定少變、高溫度脅迫下變化加劇的階段性特征，屬光合機構(gòu)次敏感位點參數(shù)。陳貽竹等[31]的研究認為，黃瓜、水稻、甘蔗、仙人掌等植物FO的突變臨界點溫度在49～56℃，茄子的Dd在52℃開始出現(xiàn)大幅度增加[40]。本研究表明：獼猴桃葉片的FO，Dd均在45℃出現(xiàn)上升臨界點，較上述研究結(jié)論明顯偏低，這與獼猴桃抗逆性較弱的生理特性相符合。