江潔怡，曾志浩，黃華靖，李素梅，胥愛麗，李養(yǎng)學(xué)

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405）

銀蘭含漱方是廣東省第二中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方，是治療脾胃濕熱或濕濁內(nèi)阻的口腔潰瘍、口臭等口腔疾病的協(xié)定處方，由金銀花、黃芩、薄荷、甘草、佩蘭、丁香組成，其中金銀花主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等成分[1]，黃芩中主要含有黃酮及黃酮苷類化合物[2]，二藥共為君藥，共奏清熱燥濕、瀉火解毒功效；佩蘭主要含揮發(fā)油、黃酮類成分[3?4]，芳香化濕，為臣藥；薄荷主要含有揮發(fā)油、黃酮類等成分[5]，丁香主要含揮發(fā)油、色酮苷等[6?7]，兩者共為佐藥；甘草主要有三萜皂苷類、甘草多糖類等化學(xué)成分[8?9]，為使藥；以上諸藥合用，共奏清熱化濁、芳香辟穢之功。

銀蘭含漱方在廣東省第二中醫(yī)院臨床口腔護(hù)理中應(yīng)用多年，能有效地治療口腔潰瘍、去除異味、防治口腔炎癥，復(fù)發(fā)率低，具有良好的應(yīng)用前景，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面仍不深入，僅建立了其檢查項(xiàng)、薄層鑒別、單成分含量測定方法，阻礙了其進(jìn)一步的推廣利用，提高及完善其質(zhì)量控制體系成了亟待解決的問題。眾所周知，化學(xué)成分是藥效物質(zhì)發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，中藥特別是復(fù)方制劑，化學(xué)成分復(fù)雜，且具有多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，單一指標(biāo)成分難以全面評價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量，而指紋圖譜技術(shù)能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)。在此基礎(chǔ)上，指紋圖譜結(jié)合模式識別方法能有效彌補(bǔ)現(xiàn)有質(zhì)量控制方法的不足[10?11]。本研究對15批銀蘭含漱方進(jìn)行指紋圖譜研究，測定其中甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素6個(gè)成分的質(zhì)量濃度，并應(yīng)用指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)合PCA分析和PLS?DA分析對其結(jié)果進(jìn)行分析，為銀蘭含漱方的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為其開發(fā)成為安全有效、穩(wěn)定可控的中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1290色譜儀（美國Agilent公司）；XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；Milli?QAdvantage型A10自動型純水機(jī)（美國Millipore公司）。

綠原酸（批號：110753?201415，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、甘草苷（批號：111610?201106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.7%）、黃芩苷（批號：110715?201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%）、漢黃芩苷（批號：112002?201702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、黃芩素（批號：111595?201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、甘草酸銨（批號：110731?201116，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；隱綠原酸（批號：Y?067?180425，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、新綠原酸（批號：RFS?X01411804010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.83%）、漢黃芩素（批號：H?029?160802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲酸、磷酸、乙腈等液相用試劑為色譜純（德國Merck公司）；甲醇等其余試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

銀蘭含漱方（批號：20180201、20180202、20180203、20180501、20180502、20180503、20180801、20180802、20180803、20190101、20190102、20190103、20190401、20190402、20190403，依次編號為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15）由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密量取銀蘭含漱方約1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 陰性樣品溶液的制備

按照銀蘭含漱方的處方和制備工藝，分別制備缺金銀花、黃芩、薄荷、甘草、佩蘭、丁香的陰性樣品，再按“2.1”項(xiàng)方法制備6種陰性樣品溶液。

2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，分別加甲醇制成含隱綠原酸（245.00μg/mL）、新綠原酸（367.50μg/mL）、綠原酸（225.00μg/mL）、甘草苷（292.22μg/mL）、黃芩苷（741.42μg/mL）、漢黃芩苷（215.52μg/mL）、黃芩素（181.67μg/mL）、甘草酸銨（237.78μg/mL）、漢黃芩素（124.72μg/mL）的溶液，作為對照品儲備液。

分別取上述對照品溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成含隱綠原酸24.50μg/mL、新綠原酸36.75μg/mL、綠原酸22.50 μg/mL、甘草苷29.22μg/mL、黃芩苷24.71μg/mL、漢黃芩苷17.96μg/mL、黃芩素18.16μg/mL、甘草酸銨23.78μg/mL、漢黃芩素12.47μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件

采用Phenomenex Luna Omega PS C1（82.1 mm×150 mm，1.6μm）色譜柱；柱溫為30℃；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸（含0.05%磷酸）為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫（0~2 min，5%→11%A；2~7 min，11%A；7~10 min，11%→20%A；10~17 min，20%→28%A；17~19 min，28%→30%A；19~22 min，30%→58%A；22~25 min，58%A）；流速為0.40 mL/min；檢測波長為245 nm；進(jìn)樣量為1μL；理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于5 000。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號20190101），按“2.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖，以漢黃芩苷峰（10號峰）為參照，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批次樣品（批號20190101），按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行6份，并按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以漢黃芩苷峰（10號峰）為參照，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（20190101），按“2.4”項(xiàng)色譜條件，分別在放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測試，記錄色譜圖，以漢黃芩苷峰（10號峰）為參照，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià) 分別精密吸取不同批次（S1~S15）的銀蘭含漱方供試品溶液及混合對照品溶液各1μL，注入U(xiǎn)PLC色譜儀中，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，將記錄得到的各批次色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，自動匹配，生成共有模式圖，標(biāo)定了13個(gè)共有峰為特征峰，并通過與對照品保留時(shí)間及紫外全波長掃描圖比對，指認(rèn)了其中9個(gè)共有峰，分別為1號峰隱綠原酸、3號峰新綠原酸、4號峰綠原酸、6號峰甘草苷、7號峰黃芩苷、10號峰漢黃芩苷、11號峰黃芩素、12號峰甘草酸、13號峰漢黃芩素，見圖1、2。15批銀蘭含漱方供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.964、0.982、0.998、0.960、0.997、0.994、0.973、0.998、0.998、0.996、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999，均 大于0.9，相似度評價(jià)表明，15批供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相關(guān)性良好，各批次銀蘭含漱方化學(xué)成分一致，主要差異表現(xiàn)在各成分的含量上。

圖1 15批銀蘭含漱方UPLC疊加圖譜Figure 1 UPLCoverlay chromatograms of 15 batches of Yin?lan Hanshufang

圖2 銀蘭含漱方對照指紋圖譜Figure 2 Comparison fingerprint of Yinlan Hanshufang

2.5.5 銀蘭含漱方指紋圖譜PCA分析 分別使用SPSS 26.0軟件和SIMCA 14.1軟件對15批銀蘭含漱方的指紋圖譜共有峰峰面積歸一化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析。

首先采用SIMCA 14.1軟件，對15批銀蘭含漱方樣品進(jìn)行主成分分析（PCA），選取特征值最大的4個(gè)主成分進(jìn)行擬合分析，其累積方差貢獻(xiàn)率94.138%，得到15批銀蘭含漱方樣品的Scores圖，見圖3。結(jié)果顯示，所有樣品均在95%可信區(qū)間內(nèi)，且15批樣品沒有明顯的聚類趨勢，說明15個(gè)批次的銀蘭含漱方質(zhì)量較一致。

圖3 15批銀蘭含漱方的二維主成分得分圖Figure 3 Two dimensional principal component score scatter of 15 batches of Yinlan Hanshufang

表2 銀蘭含漱方主成分因子載荷矩陣Table 2 Principal component load matrix of Yinlan Hanshu?fang

采用SPSS 26.0軟件，提取特征值大于1的成分，得到主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率、主成分載荷矩陣（見表1、2）。由結(jié)果可知，前4個(gè)主成分的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.138%，其代表了15批樣品中13個(gè)共有峰的94.138%信息量，體現(xiàn)了樣品的基本特征和主要信息，其中第1主成分信息主要來自2、3、5~10、13號峰；第2主成分信息主要來自4號峰；第3主成分信息主要來自1、11號峰；第4主成分信息主要來自12號峰，上述成分在特征變量的重要性評估中具有優(yōu)勢。2.5.6 PLS?DA分析 將15批銀蘭含漱方按照生產(chǎn)月份分為201802、201805、201808、201901、201904共5類，采用SIMCA 14.1軟件，對15批銀蘭含漱方中13個(gè)共有峰峰面積歸一化處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS?DA分析，得到變量重要性投影（Variable Impor?tance in Projection,VIP）值圖（見圖4）。由VIP圖可直觀得出各色譜峰影響程度，依次為2號峰>6號峰>9號峰>5號峰>7號峰>8號峰>4號峰>10號峰>12號峰>3號峰>13號峰>1號峰>11號峰。13個(gè)共有峰中，2號峰、6號峰（甘草苷）、9號峰、5號峰、7號峰（黃芩苷）、8號峰、4號峰（綠原酸）、10號峰（漢黃芩苷）的VIP值大于1，說明變量對模型分類的貢獻(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為差異標(biāo)志物。

表1 銀蘭含漱方PCA特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 1 PCA eigenvalues and variance contribution rate of Yinlan Hanshufang

圖4 15批銀蘭含漱方PLS?DA模型中11個(gè)共有峰的VIP值圖Figure 4 VIPvalues of 11 common peaks in PLS?DA model of 15 batches of Yinlan Hanshufang

2.6 多指標(biāo)含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同體積的各對照品儲備溶液，加甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度分別含 甘 草 苷29.20、87.60、146.00、204.40、262.80、292.00μg/mL；黃芩苷247.14、741.42、1 235.70、1 729.98、2 224.26、2 471.40μg/mL；漢黃芩苷17.96、35.92、53.88、71.84、89.80、107.76μg/mL；黃芩素18.16、54.48、90.80、127.12、163.44、181.60μg/mL；甘草酸23.78、71.34、118.90、166.46、214.02、237.80 μg/mL；漢黃芩素12.47、37.41、62.35、87.29、112.23、124.70μg/mL的系列對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液1μL，注入U(xiǎn)PLC色譜儀，按“2.4”項(xiàng)色譜條件測定，記錄各色譜峰峰面積。以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 3 Results of the linear relationship

2.6.2 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)的混合對照品溶液、“2.1”項(xiàng)供試品溶液及“2.2”項(xiàng)各陰性樣品溶液1μL，按“2.4”項(xiàng)色譜條件依法進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，待測成分甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素可與相鄰成分達(dá)到基線分離，陰性樣品無干擾。

圖5 對照品、供試品與陰性樣品的色譜圖Figure 5 UPLCchromatograms of mixed reference substanc?es,test sample and negative sample

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（20190101），按“2.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄各峰峰面積，計(jì)算得RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取一批次樣品（20190101），按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行6份，并按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各峰峰面積，計(jì)算得到甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素RSD值分別為1.18%、1.28%、1.16%、0.95%、1.07%、1.22%，RSD均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（20190101），按“2.4”項(xiàng)色譜條件，分別在放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測試，記錄各峰峰面積，計(jì)算得RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 中間精密度試驗(yàn) 分別由2名不同分析人員在不同日期和不同色譜儀下操作，取同一批次樣品（20190101），按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，每次平行6份，并按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各峰峰面積，計(jì)算得到各成分含量及RSD，結(jié)果RSD均小于2%，表明分析方法中間精密度良好。

2.6.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9份已測定含量樣品（20190101）0.5 mL，分別精密加入一定量的對照品，分別按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液9份，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得到甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素的平均加樣回收率分別為97.91%、100.85%、97.99%、100.01%、98.91%、98.85%，RSD分別為1.95%、1.23%、1.94%、1.78%、1.92%、1.43%。

2.6.8 樣品質(zhì)量濃度測定 取15批銀蘭含漱方樣品，分別按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算各批次中甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。

從表4可見，15批銀蘭含漱方中各批次之間的成分質(zhì)量濃度差異比較大。甘草苷的質(zhì)量濃度為0.22～0.57μg/mL，平均為0.37μg/mL，其中S1的濃度最低；黃芩苷的質(zhì)量濃度為0.11～3.25μg/mL，平均為2.10μg/mL，各批次之間的差異比較大，其中S15的最高；漢黃芩苷的質(zhì)量濃度為0.21～0.68μg/mL，平均為0.44μg/mL；黃芩素的質(zhì)量濃度為0.05～0.23μg/mL，平均為0.10μg/mL；甘草酸的質(zhì)量濃度為0.03～0.14μg/mL，平均為0.08μg/mL；漢黃芩素的質(zhì)量濃度為0.14～0.45μg/mL，平均為0.27μg/mL。

表4 15批銀蘭含漱方樣品質(zhì)量濃度測定結(jié)果Table 4 Results of determination of 15 batches of Yinlan Hanshufang ρ/(mg·mL?1)

3 討論

研究前期將所制備的供試品溶液在波長210～400 nm進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在波長為245 nm處各色譜峰的豐度、數(shù)目、分離度較好，故選擇該波長為檢測波長。為了得到更優(yōu)的色譜條件，先后考察了不同色譜柱（Waters CORTECSUPLC T3、Phenomenex Luna Omega PS、Agilent Poroshell 120 EC C18）、不同流動相體系（乙腈?0.1%甲酸水溶液、乙腈?0.1%甲酸（含0.05%磷酸）水溶液、甲醇?0.1%冰醋酸水溶液）、不同柱溫（30、35、40℃）以及不同流速（0.25、0.30、0.35 mL/min），確定了最終的色譜條件。

本研究在銀蘭含漱方多成分含量測定和指紋圖譜相似度評價(jià)的分析基礎(chǔ)上，結(jié)合PCA模型對銀蘭含漱方不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的一致性進(jìn)行分析。第1主成分的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到64.192%，該主成分信息主要來自新綠原酸、甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、2號峰和5號峰等成分，這些成分主要來源于金銀花、黃芩、甘草3味藥材。本方的君藥為金銀花和黃芩，其中黃芩苷和漢黃芩苷來源于黃芪，而綠原酸非全部來源于金銀花。另外，根據(jù)PLS?DA的VIP值分析，黃芩苷和漢黃芩苷的VIP值均大于1，可作為差異標(biāo)志物，因此本試驗(yàn)只考慮君藥黃芪藥材的質(zhì)量對成品的影響。S1~S6的黃芩藥材來源于山西省，S7~S15的黃芩藥材來源于河北省，根據(jù)PCA模型預(yù)判，可知2個(gè)產(chǎn)地藥材之間的差異不大。

本研究指認(rèn)了隱綠原酸、新綠原酸、綠原酸、甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素9個(gè)成分，在專屬性考察試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)供試品的隱綠原酸、新綠原酸和綠原酸有陰性干擾。因此，在考察質(zhì)量濃度時(shí)只測定甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素6種成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示黃芩苷的質(zhì)量濃度最高，而黃芩素和甘草苷的最低，建議不對黃芩素和甘草苷進(jìn)行質(zhì)量控制。以15批樣品質(zhì)量平均值的70%~130%設(shè)限，暫將含量限度定為甘草苷0.26~0.48 mg/mL、黃芩苷1.47~2.73 mg/mL、漢黃芩苷0.31~0.57 mg/mL、漢黃芩素0.19~0.35 mg/mL。

15批銀蘭含漱方特征圖譜相似度較高，說明制劑工藝穩(wěn)定；而15批銀蘭含漱方樣品各批次之間的成分含量差異較明顯，這可能與投料藥材的產(chǎn)地、采收期等因素有關(guān)，為了保證成品質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，必須從原藥材的質(zhì)量出發(fā)，建立原藥材的入選標(biāo)準(zhǔn)。本研究僅從化學(xué)成分層面出發(fā)，對銀蘭含漱方質(zhì)量進(jìn)行控制，下一步可結(jié)合藥理研究，明確其質(zhì)量標(biāo)志物，保證產(chǎn)品的安全、有效。