王思敏，陳紫航，羅雪霞，楊艷紅，雷自立

[1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（臨床醫(yī)學(xué)院），廣東廣州 510080；2.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東廣州 510006]

胃癌（gastric cancer,GC）已成為威脅全球健康的主要疾病之一，根據(jù)報道，2018年全球胃癌新發(fā)病例約為103萬，在全部惡性腫瘤中排名第5[1],胃癌在東亞地區(qū)特別是中國發(fā)病率極高[2]。盡管在過去幾年，胃癌的存活率有所提高，但預(yù)后仍不容樂觀，大大降低了人們的生活質(zhì)量，加重了家庭負(fù)擔(dān)[3]。胃癌主要治療方法有手術(shù)、放療、化療等[4?5]，化療通常有較大不良反應(yīng)。因此，需要尋找更多具有抗腫瘤潛能的藥物。

黃連素（berberine,BBR）是一種生物活性堿，其成分主要是小檗堿，可以從我國傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏等中提取[6]。黃連素在臨床上多用來治療腹瀉和胃腸炎癥[7]，近幾年發(fā)現(xiàn)黃連素有抗炎、抗氧化和器官保護(hù)作用，在肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中有明顯的抗腫瘤作用[8?10]，但目前黃連素與胃癌相關(guān)的研究不多，黃連素抑制胃癌的機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗室前期研究工作發(fā)現(xiàn)黃連素可以通過調(diào)控增殖、凋亡、壞死、自噬及細(xì)胞連接相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞的作用，進(jìn)一步采用miRNA測序和RNA測序方法建立了黃連素處理SGC?7901的miR?NA和mRNA表達(dá)譜,在RNA測序中鑒定出1 960個上調(diào)基因和4 837個下調(diào)基因；Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析表明，這些差異表達(dá)的基因與癌癥和代謝等途徑有關(guān)，進(jìn)一步分析了細(xì)胞周期、凋亡、炎癥、代謝、細(xì)胞連接、乙酰化過程等基因的miRNA?mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在黃連素處理的SGC?7901細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一些新的抗腫瘤途徑，提示黃連素有可能通過調(diào)控Hippo信號通路發(fā)揮抑制腫瘤的作用[11]。

Hippo信號通路作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一條通路，在器官發(fā)育調(diào)控方面起重要作用，越來越多的研究表明Hippo信號通路在多種癌癥包括胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[12]。幽門螺旋桿菌感染是近年來公認(rèn)的重要胃癌危險因素之一，Amieva MR等[13]報道在胃炎和幽門螺旋桿菌感染患者中往往有細(xì)胞間連接失調(diào)，導(dǎo)致Hippo信號通路紊亂，加大了胃癌的患病風(fēng)險。miR?375是一種能抑制胃癌的microRNA，異位表達(dá)的miR?375在體內(nèi)外均能抑制胃癌細(xì)胞的生長，Kang等[14]發(fā)現(xiàn)Hippo通路中3個組分YAP1、TEAD4和CTGF的表達(dá)水平與miR?375的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，是miR?375的直接靶點(diǎn)。有關(guān)Hippo信號通路在胃癌中發(fā)揮重要作用的報道不少，但此前未見關(guān)于黃連素通過調(diào)控Hippo信號通路發(fā)揮抑制胃癌作用的類似報道。本實(shí)驗室前期工作通過RNA測序提示黃連素可能通過調(diào)控Hip?po信號通路發(fā)揮抑制胃癌的作用，本研究進(jìn)一步利用人胃癌細(xì)胞系HGC?27驗證黃連素通過調(diào)控Hip?po通路作用抑制胃癌的分子機(jī)制，為黃連素在胃癌臨床防治中的潛在應(yīng)用提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 人胃癌細(xì)胞系HGC?27（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；黃連素（碧云天生物技術(shù)公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，相對分子質(zhì)量371.82）；DMSO（廣州瑞舒生物科技有限公司）；10%（φ）胎牛血清、RP?MI1640培養(yǎng)基、胰酶以及PBS緩沖溶液（美國Hy?Clone公司）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；DEPC·H2O、引物（上海生工生物工程股份有限公司）；氯仿、異丙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司）；超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；Piko?Real 96型Real?time PCR儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 人胃癌細(xì)胞HGC?27常規(guī)置于1640完全培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，在37°C、5%（φ）CO2條件下培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞消化計數(shù)，以1×105/孔接種于6孔板中，將細(xì)胞分為3組：對照組、黃連素5μmol/L濃度組和黃連素10μmol/L濃度組。將黃連素溶于DMSO，配制濃度為5μmol/L和10μmol/L的黃連素。待細(xì)胞長至80%~90%時棄培養(yǎng)液，每孔加入新鮮的培養(yǎng)基2 mL，對照組、黃連素5μmol/L濃度組和黃連素10μmol/L濃度組分別加入20μL DMSO、5μmol/L和10μmol/L黃連素，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 利用Real?time PCR檢測Hippo信號通路重要基因的表達(dá)水平 對照組及黃連素組的細(xì)胞棄上清，用PBS清洗3遍。加入RNA裂解酶Trizol裂解。裂解液經(jīng)氯仿抽提（每1 mL Trizol加0.2 mL）、異丙醇沉淀（每1 mL Trizol加入0.5 mL）、75%（φ）乙醇（每1 mLTrizol加入1 mL）洗鹽，沉淀干燥后以適量DEPC?H2O溶解，紫外分光光度計測吸光度（A）值，?80℃保存。反轉(zhuǎn)錄按PrimeScript RT reagent Kit說明書操作，得到cDNA作為Real?time PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)NCBIGene網(wǎng)頁公布的基因序列，利用NCBI在線引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物序列見表1。使用Thermo Piko Real?time PCR系統(tǒng)，10μL反應(yīng)體系包括:上下游引物（10μmol/L）各0.2μL，cDNA模板（100 ng）1μL，SYBR Green反應(yīng)液5μL，dH2O補(bǔ)齊至10μL。PCR循環(huán)參數(shù)為:95°C預(yù)變性30 s，95°C 45 s，60°C 20 s，65°C 15 s，40個循環(huán)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析數(shù)據(jù)，GAPDH作為內(nèi)對照,檢測黃連素處理后Hippo信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化，融解曲線用來保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.2.3 利用Western blot檢測Hippo信號通路重要蛋白的表達(dá)水平 用1×PBS充分洗滌細(xì)胞，再用裂解液（按RIPA∶蛋白酶抑制劑=100∶1的體積比）裂解細(xì)胞抽提總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取20μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗。電轉(zhuǎn)后的PVDF膜用含5%BSA的TBST封閉1 h，再分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。次日，經(jīng)TBST（10 min×3次）洗滌后，分別加入相應(yīng)辣根過氧化物酶（horse?radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，以GAPDH為內(nèi)參，利用image Lab和image J計算灰度值，對目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。抗體信息見表2。

表2 抗體信息Table2 Antibody information

1.2.4 統(tǒng)計分析 所有實(shí)驗重復(fù)3次，計量資料以±s表示。使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布變量多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對HGC?27細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

黃連素處理24 h后鏡下可觀察到，視野中黃連素5、10μmol/L組貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，有些出現(xiàn)了空泡，懸浮細(xì)胞增加（見圖1），提示黃連素對HGC?27胃癌細(xì)胞有抑制作用。

圖1 黃連素對HGC?27細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 1 Effect of berberine on the morphology of HGC?27 cells

2.2 黃連素對HGC?27胃癌細(xì)胞中Hippo通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的影響

與對照組相比，黃連素組中TEAD3（5μmol/L組P<0.05；10μmol/L組P<0.01）、TEAD4（5μmol/L組P<0.05；10μmol/L組P<0.01）、YAP（10μmol/L組P<0.01）及CyclinE1（10μmol/L組P<0.01）表達(dá)水平顯著下降，呈濃度依賴性的趨勢；MST1表達(dá)水平顯著高于對照組（10μmol/L組P<0.05）。見圖2。

圖2 利用Real?time PCR檢測黃連素處理后HGC?27細(xì)胞中Hippo信號通路基因表達(dá)的影響Figure 2 Effect of berberine on the expression of Hippo signaling pathway genes in HGC?27 cells detected by real?time PCR

2.3 黃連素對HGC?27胃癌細(xì)胞中Hippo通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平的影響

進(jìn)一步利用Western blot檢測了MST1、YAP、TEAD3、TEAD4及CyclinE蛋白的表達(dá)水平。與對照組相比，黃連素組中TEAD4（5μmol/L組P>0.05；10μmol/L組P<0.05）、YAP（5μmol/L組P>0.05；10μmol/L組P<0.01）及CyclinE1（10μmol/L組P<0.01）表達(dá)水平顯著下降，TEAD3表達(dá)水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；MST1和p?YAP表達(dá)水平顯著升高（10μmol/L組P<0.05），p?MST1表達(dá)水平也呈現(xiàn)上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3和圖4。

圖3 Western blot檢測黃連素處理后HGC?27細(xì)胞中Hippo信號通路蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of berberine on the expression of Hippo signaling pathway proteins in HGC?27 cells detected by western blot

圖4 利用灰度計算黃連素處理后HGC?27細(xì)胞中Hippo信號通路蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of berberine on the expression of Hippo signaling pathway proteins in HGC?27 cells by gray calculation

3 討論

在腫瘤化療治療中，尋找高效低毒且多靶點(diǎn)的藥物已成為研究熱點(diǎn)[5,15],而黃連素作為一種多年來在臨床中應(yīng)用于胃腸道炎癥的中藥，目前發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤的作用[16]。

Hippo通路研究始于1994年果蠅wts基因的發(fā)現(xiàn)[17]，故以果蠅ste?20樣激酶Hippo命名。研究表明Hippo信號通路在細(xì)胞增殖與分化、組織損傷再生、腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，并參與腸道中眾多生理及病理進(jìn)程的調(diào)控[18]。Hippo信號通路包括上游調(diào)節(jié)分子、核心分子及主要的下游效應(yīng)分子3部分，其核心激酶鏈包括MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOB1等，而YAP/TAZ為主要的下游效應(yīng)分子[19]。Hippo信號通路受到機(jī)械環(huán)境、G蛋白耦聯(lián)受體信號、細(xì)胞能量水平、氧化應(yīng)激和缺氧等多種信號調(diào)控，當(dāng)Hippo信號通路被激活時，MST1/2在支架蛋白SAV1的協(xié)助下，磷酸化MOB1和LATS1/2并加強(qiáng)它們之間的相互作用，磷酸化的LATS1/2被激活，然后在多個位點(diǎn)上磷酸化YAP/TAZ，磷酸化的YAP/TAZ滯留在細(xì)胞質(zhì)中，被泛素化降解，從而抑制細(xì)胞生長、增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。當(dāng)Hippo信號通路受到抑制時，YAP去磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核中，主要與TEAD家族的DNA結(jié)合因子配對，通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白CyclinE、結(jié)締組織生長因子CT?GF等基因的表達(dá)來刺激細(xì)胞增殖[20]。Hippo信號通路失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[21]。

蛋白激酶（mammalian sterile 20?like kinase1/2，MST1/2）是體內(nèi)普遍表達(dá)的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，可在外界刺激下參與細(xì)胞凋亡，是哺乳動物中重要的抑癌基因[22]。MST1/2基因全身敲除的小鼠胚胎中，往往有肝臟、心臟、胃和脾的急劇過度生長[23]。與正常胃黏膜相比，胃癌組織中的MST1/2水平通常降低[24]。本實(shí)驗用黃連素處理HGC?27細(xì)胞系24 h后，MST1基因表達(dá)水平顯著上升，Western blot結(jié)果表明磷酸化和非磷酸化MST1蛋白水平表達(dá)上調(diào)，說明黃連素可通過激活MST1的表達(dá)來抑制腫瘤的生長，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

Yes相關(guān)蛋白（Yes?associated protein，YAP）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，是Hippo信號通路的一個關(guān)鍵蛋白，最近研究表明，YAP和許多癌癥的啟動和實(shí)體瘤增長有關(guān)[25?26]。在胃癌黏膜中Hippo通路的YAP表達(dá)水平明顯高于其在正常胃黏膜中的表達(dá)水平，在胃癌MKN?28/74細(xì)胞系中敲除YAP基因，細(xì)胞的增殖侵襲能力下降[27]。這些均提示Hippo通路通過YAP這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對胃癌具有一定影響。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，黃連素處理后的HGC?27胃癌細(xì)胞中YAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。隨著黃連素濃度升高，YAP磷酸化失活，p?YAP蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而YAP表達(dá)水平則下降。這表明黃連素有可能通過激活Hippo通路中的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子YAP，使其磷酸化后被泛素化降解，無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，從而抑制了下游相關(guān)增殖、生長基因的表達(dá)。

TEA domain transcription factors（TEAD）是YAP在下游調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子，在細(xì)胞增殖再生和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[28]。Guan實(shí)驗室對人類轉(zhuǎn)錄因子庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)TEADs可作為YAP激活最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子[29]。VGLL4與TEAD競爭結(jié)合YAP阻礙TEAD的激活，抑制胃癌細(xì)胞的生長[30]。Jiao等[31]通過轉(zhuǎn)染TEAD4突變體破壞DNA結(jié)構(gòu)，阻礙YAP誘導(dǎo)的TEAD4激活和靶基因轉(zhuǎn)錄，抑制胃癌細(xì)胞HGC?27的生長和集落形成。本研究檢測到黃連素處理組TEAD3和TEAD4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，證明黃連素有可能是通過YAP磷酸化降解、抑制TEADs，從而抑制胃癌HGC?27細(xì)胞的生長。

CyclinE是G1期細(xì)胞周期增殖信號的蛋白，過表達(dá)促使細(xì)胞過度增殖而發(fā)生癌變[32]。YAP通過直接靶向細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，加速細(xì)胞分裂[17]。Zhang等[33]通過Oncomine、The Cancer Genome Atlas datasets等基因庫的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)Cyclin家族的高表達(dá)往往與胃癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，其中胃癌組織CyclinE的mRNA水平往往高于正常胃組織。前期實(shí)驗室研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連素將MCF?7細(xì)胞明顯阻滯在細(xì)胞周期G1期[11]。在本研究中，CyclinE1表達(dá)水平的下降表明黃連素的抗腫瘤作用與調(diào)控Hippo通路有關(guān)。

本實(shí)驗室前期工作通過生物信息學(xué)分析預(yù)測到黃連素可能通過調(diào)控Hippo信號通路這一潛在靶點(diǎn)抑制胃癌細(xì)胞的增殖，為了進(jìn)一步闡明黃連素抗腫瘤作用的分子機(jī)制，本研究利用Real?time PCR和Western blot檢測了黃連素處理人胃癌細(xì)胞HGC?27中Hippo信號通路中的重要分子MST1、YAP、TEAD3、TEAD4和CyclinE1等的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞HGC?27中黃連素通過促進(jìn)MST1磷酸化激活Hippo信號通路，進(jìn)而磷酸化關(guān)鍵效應(yīng)因子YAP，使其失活，并且降低了TEAD4、YAP的靶基因CyclinE1的表達(dá)水平，從而抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究探討了黃連素通過調(diào)控Hippo信號通路抑制胃癌細(xì)胞的分子機(jī)制，為黃連素在胃癌臨床治療方面的潛力和機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為胃癌治療和預(yù)后的分子機(jī)制提供了新靶點(diǎn)。