陳希妍 張建新 孔令宇 牛麗丹 李廣鵬 朱秀英 石金河

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科(衛(wèi)輝 453100)

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見(jiàn)的胰腺無(wú)菌性炎癥，由于其發(fā)病機(jī)制并不明確，對(duì)其有效的治療方式也較為缺乏，可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官衰竭[1- 2]。微小RNA(microRNA, miRNA)是長(zhǎng)度約為20- 22核苷酸的非編碼RNA，其具有調(diào)控靶基因表達(dá)的作用，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。研究顯示上調(diào)miR- 383的表達(dá)可抑制AP病程中胰腺腺泡細(xì)胞的自噬功能[3]。miR-148a可通過(guò)Hedgehog信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的自噬[4]，并且死亡患者血清miR-148a相對(duì)表達(dá)量低于生存患者，提示miR-148a可能與急性胰腺炎患者的預(yù)后存在聯(lián)系[5]。而miR-148a是否可通過(guò)調(diào)節(jié)AP過(guò)程中腺泡細(xì)胞的自噬而調(diào)節(jié)炎性因子的釋放及腺泡細(xì)胞的活性還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以AR42J細(xì)胞為研究對(duì)象, 利用AP模型，檢測(cè)miR-148a對(duì)AP過(guò)程中細(xì)胞自噬的影響，為臨床AP的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

大鼠AR42J細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司。?；悄懰徕c鹽(TLCs)購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。miR-148a mimics、陰性對(duì)照miR-148a、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自于蘇州吉瑪基因公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。Beclin1抗體購(gòu)自于美國(guó)SANTA Cruz公司，LC3抗體購(gòu)自于美國(guó)CST公司，GAPDH抗體購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠胰腺AR42J細(xì)胞的培養(yǎng) AR42J細(xì)胞培養(yǎng)于的RPMI1640培養(yǎng)液中(含20%胎牛血清，含100 U/mL 青霉素及0.1 mg /mL鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2的無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的使用說(shuō)明，利用Lipofectamine 2000將 miR-148a mimics與陰性對(duì)照miR-148a轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞中。細(xì)胞分為正常對(duì)照組(正常培養(yǎng)48 h，normal control group)、模型組(正常培養(yǎng)48 h后TLCs刺激20 min, model group)、陰性對(duì)照miR-148a組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miR-148a 48 h后，TLCs刺激20 min，miR-148a negative control group)，miR-148a mimics組(轉(zhuǎn)染miR-148a mimics 48 h后，TLCs刺激20 min，miR-148a mimics group)。

1.3.3 利用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞接種于6孔板中，按照上述方法分為4組，在TLCs刺激20 min后分別提取各組細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)RNA濃度與純度后，利用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)變化，(miR-148a Forward: 5′-ATGCTCAGTGCACTACAGAA- 3′; miR-148a Reverse: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′)，所有步驟均按照試劑盒及儀器的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.4 利用CCK- 8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為5×103個(gè)/孔，將細(xì)胞分為上述4組，在TLCs刺激20 min后檢測(cè)各組細(xì)胞活性，每孔加入10 μL CCK- 8溶液，正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值。

1.3.5 利用ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞接種于6孔板中，按照上述方法分為4組，在TLCs刺激20 min后分別收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL- 6，IL-1β及TNF-α的含量，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(450 nm)，計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的含量(pg/mL)。

1.3.6 利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Beclin1，LC3蛋白的表達(dá)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞接種于6孔板中，按照上述方法分為4組，在TLCs刺激20 min后分別提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉膜1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，抗體濃度分別是Beclin1抗體(1:500)，LC3抗體(1:1 000)及GAPDH抗體(1:10 000)，熒光II抗(1:1 000)孵育，曝光，利用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)

為了檢測(cè)miR-148a在AP腺泡細(xì)胞中的作用，我們轉(zhuǎn)染miR-148a mimics及陰性對(duì)照 miR-148a至AR42J細(xì)胞后，用TLCs刺激20 min，然后檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)變化，結(jié)果見(jiàn)圖1，與正常對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)下降(P=0.000 6)，與陰性對(duì)照 miR-148a組相比較，二者無(wú)差異；與模型組及正常對(duì)照組相比較，miR-148a mimics組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)均升高(P=0.000 4，P=0.000 8)，細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)升高，說(shuō)明miR-148a mimics成功轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞中。

圖1 各組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)(***P<0.001)

2.2 各組細(xì)胞活性

結(jié)果見(jiàn)圖2，與正常對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞的活性降低(P=0.000 8)，而與陰性對(duì)照miR-148a組相比較，兩組細(xì)胞活性無(wú)明顯差異；與模型組相比較，miR-148a mimics組細(xì)胞活性升高(P=0.005)，而與正常對(duì)照組比較，其細(xì)胞活性仍低于正常對(duì)照組中細(xì)胞的活性(P=0.009)。

圖2 利用CCK- 8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活性(**P<0.001，***P<0.001)

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL- 6、IL-1β、TNF-α的含量

與正常對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL- 6的含量升高(P=0.004,P=0.003,P=0.006)，而與陰性對(duì)照miR-148a組相比較，兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子的含量無(wú)差異；與模型組相比較，miR-148a mimics組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL- 6的含量降低(P=0.005,P=0.000 7,P=0.001)，而與正常對(duì)照組比較，它們的含量仍高于正常對(duì)照組中細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的含量

2.4 各組細(xì)胞中Beclin1，LC3蛋白的表達(dá)變化

Western blot結(jié)果見(jiàn)圖3，與正常對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)升高(P=0.000 9)，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也升高(P=0.000 6)，而與與陰性對(duì)照miR-148a組相比較，二組細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率無(wú)差異；與模型組相比較，miR-148a mimics組細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)降低(P=0.004)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也降低(P=0.000 7)，而與正常對(duì)照組比較，miR-148a mimics組細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)升高(P=0.000 4)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也升高(P=0.000 3)。

3 討 論

AP是一種發(fā)展迅速的炎癥性疾病，因其發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏特異性靶點(diǎn)，臨床常用于AP治療方法的療效并不理想，使其在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都處于較高水平[1,6]。最近，AP中基因表達(dá)的改變和信號(hào)通路的影響越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

microRNA的發(fā)現(xiàn)和研究，為AP診斷和治療提供了新的思路。miR-148a為微小RNA的一種，近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示miR-148a在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著的重要作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miR-148a可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，成為腫瘤治療的新的靶點(diǎn)[7- 9]。miR-148a可通過(guò)抑制蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路，從而抑制小鼠胰腺祖細(xì)胞的分化、增殖過(guò)程[10]。死亡患者血清miR-148a 相對(duì)表達(dá)量低于生存患者，提示miR-148a可能與急性胰腺炎患者的預(yù)后存在聯(lián)系[5]。并且，在肝臟星狀細(xì)胞的凋亡與自噬中，miR-148a發(fā)揮著重要作用，那么miR-148a在急性腺泡細(xì)胞損傷中發(fā)揮著什么樣的作用還少見(jiàn)報(bào)道。

本研究中，我們利用AR42J細(xì)胞的AP模型，轉(zhuǎn)染miR-148a mimics至細(xì)胞中，結(jié)果顯示，AP模型組細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組與miR-148a mimics組，這也與Miao B等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[11]；同時(shí)AP模型組細(xì)胞活性也顯著低于正常對(duì)照組與miR-148a mimics組。Li G等人的研究表明，miR-148a通過(guò)調(diào)節(jié)p38/絲裂原活化蛋白激酶途徑抑制椎間盤(pán)退變中促炎細(xì)胞因子[12]，Jiang K等人的研究也顯示，過(guò)表達(dá)miR-148a可顯著降低促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-1β和TNF-α等[13]。我們的研究結(jié)果也顯示，與AP模型組細(xì)胞相比較，miR-148a mimics組細(xì)胞培養(yǎng)液中促炎因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的含量顯著降低，這也與他們的研究結(jié)果相一致。這就提示，AP時(shí)細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)降低，細(xì)胞的活性降低，促進(jìn)細(xì)胞損傷，促進(jìn)炎性因子的釋放，通過(guò)提高miR-148a的表達(dá)，可提高細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞的損傷，減少炎性因子的釋放，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

自噬是一個(gè)受調(diào)控的過(guò)程，是一種程序性細(xì)胞死亡的形式，其在許多疾病中也起著重要作用，大量的研究也顯示，自噬參與AP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[14-16]。而眾多的微小RNA也可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程[17- 20]。鄭紹越等人的研究顯示，轉(zhuǎn)染miR- 383 類(lèi)似物后，細(xì)胞中Beclin1表達(dá)水平及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值下調(diào)，miR- 383可以降低急性胰腺炎時(shí)細(xì)胞自噬水平[3]，而miR-148a是否可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬參與AP中腺泡細(xì)胞的損傷?

本研究中，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AP模型組細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率顯著高于正常對(duì)照組，而miR-148a mimics組細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率顯著低于模型組，這就提示，提高模型細(xì)胞中miR-148a 的表達(dá)后，可抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率，抑制自噬過(guò)程，這也與Miao B等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[11]。

綜上所述，miR-148a可通過(guò)抑制AP過(guò)程中腺泡細(xì)胞的自噬，減少促炎因子的釋放，減輕細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。