劉國(guó)鑾,黃汝剛,楊彩霞,劉曉紅

鐵嶺市中心醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科,遼寧鐵嶺 112000

心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)是心功能異常引起心臟射血功能及心室充盈受損，最終導(dǎo)致心室泵血功能下降的臨床綜合征[1]。心衰患者的病死率較高，預(yù)后較差，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[1-2]。深入分析心衰的病理機(jī)制并尋找潛在的生物學(xué)指標(biāo)有重要意義。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子，分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解[3]。有研究顯示，circRNA與心功能有關(guān)，能參與心衰的病情進(jìn)展[4-5]。circRNA_000203在糖尿病小鼠心肌組織中表達(dá)上調(diào)，具有促纖維化作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_000203與心功能受損有關(guān)，可促進(jìn)心肌肥厚[6]。外周血circRNA水平高于相應(yīng)線性RNA水平，在血液中的水平高于肝臟、心臟和小腦組織，有可能成為血液標(biāo)本中的分子生物學(xué)標(biāo)志物[7]。本研究檢測(cè)了心衰患者血清中circRNA_000203表達(dá)水平，并分析了其與心衰患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2019年1月本院收治的124例急性心衰患者作為心衰組，其中男68例，女56例；年齡57～74歲，平均(64.01±9.79)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(22.13±3.01)kg/m2；收縮壓(116.89±10.02)mm Hg；舒張壓(75.03±6.03)mm Hg；總膽固醇(4.47±1.35)mmol/L；三酰甘油(1.50±0.76)mmol/L。根據(jù)心衰患者紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)[8]：Ⅱ級(jí)36例，Ⅲ級(jí)45例，Ⅳ級(jí)43例；基礎(chǔ)疾?。喊昴ば孕呐K病37例，缺血性心臟病32例，高血壓性心臟病28例，擴(kuò)張性心臟病27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2018》中心衰的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)年齡≥18歲；(3)NYHA分級(jí)≥Ⅱ級(jí)；(4)隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重的肝腎功能異常；(2)合并急慢性感染；(3)腫瘤；(4)免疫系疾??；(5)精神疾病。

另選取同期本院體檢中心體檢的120例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男61例，女59例；平均(62.89±10.12)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(23.06±4.11)kg/m2；收縮壓(120.84±15.90)mm Hg；舒張壓(81.43±8.75)mm Hg；總膽固醇(4.26±1.47)mmol/L；三酰甘油(1.39±0.51)mmol/L。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2血清circRNA_000203和氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平檢測(cè) 入組時(shí)抽取空腹靜脈血5 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，3 500 r/min離心5 min，留取血清于EP管中，并保存于-80 ℃冰箱中。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(FQ-PCR)檢測(cè)：用TRIzol試劑盒(上海百研生物科技有限公司)提取總RNA，隨后用Thermo Nano Drop3000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，保證A260/A280比值在1.8～2.0。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海百研生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA模板進(jìn)行FQ-PCR(內(nèi)參為GAPDH)，SYBRⅡ試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。以2-ΔΔCt表示circRNA相對(duì)表達(dá)水平[10]。引物序列：circRNA_000203上游 3′-CGA GCT GAG TGC GTC CTG TC-5′；下游′-TCG CTG GCC GTG AGT CTG T-5′；GAPDH上游5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′；下游5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。用UniCel DxI全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀及其配套試劑盒(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)檢測(cè)NT-proBNP水平。

1.3心功能檢測(cè) 用IE33彩色多普勒心臟超聲系統(tǒng)(荷蘭飛利浦公司)檢測(cè)受試者左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心房?jī)?nèi)徑(LAD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)。

1.4隨訪 對(duì)所有心衰患者進(jìn)行門診和電話隨訪，納入研究的患者均獲得有效隨訪。心衰不良預(yù)后定義為再次發(fā)生心衰或死亡。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清指標(biāo)和心功能指標(biāo)比較 心衰組circRNA_000203、NT-proBNP、LAD和LVDd高于對(duì)照組，而LVEF低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清指標(biāo)和心功能指標(biāo)比較

2.2不同NYHA分級(jí)心衰患者血清circRNA_000203表達(dá)水平比較 Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)心衰患者血清circRNA_000203相對(duì)表達(dá)水平分別為1.89±0.87、2.97±0.69、4.57±1.03，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，分級(jí)越高，血清circRNA_000203表達(dá)水平越高，見圖1。

注：與Ⅱ級(jí)患者比較，*P<0.05；與Ⅲ級(jí)患者比較，#P<0.05。

2.3心衰患者血清circRNA_000203表達(dá)水平與NT-proBNP、心功能指標(biāo)的關(guān)系 circRNA_000203表達(dá)水平與NT-proBNP、LAD、LVDd呈正相關(guān)(r=0.678、0.411、0.409，P<0.05)，而與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.555，P<0.05)，見表2。

表2 血清circRNA_000203表達(dá)水平與NT-proBNP、心功能指標(biāo)的關(guān)系

2.4不同預(yù)后患者血清circRNA_000203表達(dá)水平比較 124例患者中預(yù)后不良44例，其中再發(fā)心衰30例，死亡14例。預(yù)后不良患者circRNA_000203相對(duì)表達(dá)水平為4.56±1.10，高于預(yù)后良好患者1.90±0.94，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.544，P<0.05)，見圖2。

注：與預(yù)后不良心衰患者比較，*P<0.05。

2.5Logistic多因素分析心衰患者不良預(yù)后的影響因素 circRNA_000203、NT-proBNP、LAD、LVDd和LVEF是影響心衰患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)，見表3。

表3 Logistic多因素分析心衰患者不良預(yù)后的影響因素

續(xù)表3 Logistic多因素分析心衰患者不良預(yù)后的影響因素

2.6ROC曲線分析circRNA_000203預(yù)測(cè)心衰患者不良預(yù)后的價(jià)值 circRNA_000203預(yù)測(cè)心衰患者不良預(yù)后的AUC為0.756，當(dāng)circRNA_000203取值為2.87時(shí)約登指數(shù)最大(0.539)，即診斷價(jià)值最高，此時(shí)靈敏度和特異度分別為65.03%和88.95%，見圖3。

圖3 ROC曲線分析circRNA_000203預(yù)測(cè)心衰患者不良預(yù)后的價(jià)值

3 討 論

心衰是臨床常見疾病，深入分析其發(fā)病機(jī)制并尋找潛在生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。circRNA在心衰中的作用引起了廣泛重視，例如心臟相關(guān)circRNA(HRCR)可以靶向作用于miR-223從而調(diào)控ARC基因表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)心肌肥大和心衰的發(fā)生[11]。本研究旨在分析circRNA_000203與心衰患者心功能及預(yù)后的關(guān)系。

circRNA廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，可參與基因表達(dá)調(diào)控，具有穩(wěn)定性、高度保守性和組織發(fā)育特異性[12]。circRNA通過外泌體分泌入血液，在不易獲取病理組織的疾病中，檢測(cè)外周血circRNA可能會(huì)作為一種新型診斷疾病的方法[12-14]。circRNA在心衰的診斷及鑒別診斷、病情評(píng)估和預(yù)后評(píng)估中顯示出了良好的應(yīng)用前景[15]。既往研究顯示，circRNA_000203與心肌纖維化、心肌肥厚和結(jié)構(gòu)重塑有關(guān)[6,16]。 但是鮮有研究檢測(cè)心衰患者外周血中該指標(biāo)的表達(dá)及意義。本研究發(fā)現(xiàn)心衰患者circRNA_000203表達(dá)水平明顯高于健康者，并且NYHA分級(jí)越高，表達(dá)水平越高。提示circRNA_000203可能參與了心衰的發(fā)生。

circRNA_000203表達(dá)量與NT-proBNP、LAD、LVDd呈正相關(guān)關(guān)系，而與LVEF呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明circRNA_000203有助于心功能的評(píng)估。circRNA_000203與心衰進(jìn)展中的作用機(jī)制既往少有報(bào)道。TANG等[16]發(fā)現(xiàn)，circRNA_000203可能通過抑制miR-26b-5p、Col1a2和CTGF促進(jìn)心肌纖維化。有研究顯示，circRNA_000203過表達(dá)會(huì)提高心室肌細(xì)胞心鈉素及β肌球蛋白重鏈的表達(dá)；在circRNA_000203轉(zhuǎn)基因小鼠中，用血管緊張素Ⅱ干預(yù)后，小鼠心臟功能受損，心肌肥厚加重，上述作用可能是circRNA_000203通過抑制miR-26b-5p和miR-140-3p引起GATA4表達(dá)上調(diào)而實(shí)現(xiàn)的[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_000203是心衰患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素，預(yù)后不良患者circRNA_000203相對(duì)表達(dá)水平為4.56±1.10，高于預(yù)后良好患者1.90±0.94。另外，circRNA_000203預(yù)測(cè)心衰患者不良預(yù)后的AUC為0.756，提示該指標(biāo)對(duì)早期預(yù)測(cè)心衰預(yù)后有一定價(jià)值。但是circRNA_000203預(yù)測(cè)心衰的靈敏度僅65.03%，可能與檢測(cè)手段、病情嚴(yán)重程度等有關(guān)，聯(lián)合其他指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)可能會(huì)提高其診斷靈敏度。

綜上所述，心衰患者血清circRNA_000203表達(dá)水平升高，檢測(cè)其表達(dá)水平可能有助于評(píng)估心功能和患者預(yù)后。本研究也存在以下局限性：(1)本研究為回顧性研究，可能存在回憶偏倚和選擇偏倚；(2)未在患者入院時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)circRNA_000203表達(dá)水平；(3)未分析circRNA_000203在心衰中的作用機(jī)制。未來需要開展細(xì)胞和動(dòng)物研究進(jìn)行深入分析。