高華武，王 艷，周 鵬，葉 樹，宋 航，汪光云，蔡 標,*

（1.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中西醫(yī)結合研究所，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關的慢性、神經退行性疾病，伴隨著記憶缺失和認知功能障礙，并最終會導致患者死亡。AD是誘發(fā)進行性癡呆的主要病因之一，據(jù)估計，目前中國有1 000萬AD患者，美國有580萬AD患者，到21世紀中葉，全球癡呆患者將達到1.52億，其中約60%～70%為AD患者[1-2]。AD的發(fā)病機制復雜，至今臨床上常用的抗AD藥物效果不理想，從天然產物及其衍生物中研制抗AD的新型藥物已成為研發(fā)的重要方向，并且眾多研究結果證實天然產物及其衍生物在改善AD進程方面具有很好的療效[3-4]。

金雀異黃酮（genistein，GS），化學名稱為4’,5,7-三羥異黃酮，是大豆異黃酮的主要成分，約占大豆中總異黃酮的60%[5]，廣泛存在于大豆、玉米、大麥、小麥、黑麥等各種可食用的植物中，在大豆中最為豐富[6]。金雀異黃酮在化學結構上類似于17-β-雌二醇，有研究用金雀異黃酮模擬雌激素與其受體結合，發(fā)現(xiàn)其可在靶器官中發(fā)揮雌激素作用，但沒有雌激素的不良反應[6-8]，對更年期癥狀和更年期相關疾病，如骨質疏松癥、肥胖癥、糖尿病、焦慮癥、抑郁癥和乳腺癌等[5,9-10]有很好的療效。在AD防治方面，金雀異黃酮可以縮短AD模型動物逃避潛伏期和降低錯誤次數(shù)，改善學習記憶能力，改善大腦功能[11-12]，其機制可能與減少β淀粉樣蛋白（beta amyloid peptide，Aβ）沉積、抑制細胞凋亡、減少氧化應激和神經炎癥、誘導自噬等途徑等有關[13-15]，但是金雀異黃酮的作用機制仍然有待進一步研究。

研究表明，Ca2＋-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IV（calmodulin-dependent protein kinase IV，CaMKIV）信號通路在AD的發(fā)病中起著重要的作用。Aβ在神經元細胞中的沉積導致Ca2＋濃度增加，超載的Ca2＋和鈣調蛋白（calmodulin，CaM）的結合激活了鈣-鈣調素復合物（Ca2＋/CaM）的活性。進入細胞核后，Ca2＋/CaM激活鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶激酶（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase，CaMKK）及其底物CaMKIV促使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）激酶磷酸化，進而磷酸化Tau，過度磷酸化的Tau蛋白是異常神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）的主要組成部分，是AD臨床表達的重要因素。因此，通過CaM-CaMKIV信號通路抑制Tau蛋白過磷酸化是預防和治療AD的重要方法[16-17]。本實驗用Aβ25-35誘導海馬神經元損傷建立AD細胞模型，以抑制Ca2＋超載和介導Ca2＋-CaMKIV信號通路為切入點，觀察金雀異黃酮對海馬神經元損傷的保護作用，探討金雀異黃酮對海馬神經元保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級24 h內新生SD乳鼠（生產許可證號：SCXK（皖）2017-001），雌雄各半，購自安徽省動物實驗中心。動物飼養(yǎng)于安徽省中醫(yī)藥科學院中西醫(yī)結合研究所，控制室溫18～25 ℃、相對濕度40%～70%。實驗過程中對動物的處置已通過安徽中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。

金雀異黃酮（純度≥98%，批號：C1431028） 上海Aladdin公司；戊酸雌二醇（estradiol valerate，EV）片（批號：185A） 法國DELPHARM Lille S.A.S公司；Aβ25-35（批號：095M4775V） 美國Sigma公司；Hoechst 33258 上海百豪生物科技有限公司；抗MAP-2的小鼠抗體（1∶200）、Cy3標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G抗體（1∶200） 北京Bioss公司；Hoechst 33258（5 μg/mL） 上海Beyotime公司；CaM、CaMKK抗體 英國Abcam公司；CaMKIV、tau抗體 美國Cell Signaling technology公司。

1.2 儀器與設備

BD C6流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；FluorChem M凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司；042BR12088電泳儀 美國Bio-Rad公司；IX81倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；AE2000倒置顯微鏡 廈門Motic公司；多功能酶標儀 上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海馬神經元的原代培養(yǎng)

取新生SD乳鼠，體積分數(shù)75%乙醇溶液中浸泡20 s消毒后頸椎脫臼處死，剝離海馬組織，用0.125%（體積分數(shù)，下同）胰酶消化20 min，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，反復吹打形成細胞懸液，200 目篩過濾后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，在沉淀中加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后，調整細胞密度至1×106cells/mL，然后接種至由多聚賴氨酸覆蓋的細胞板中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基在24 h后更換為神經元培養(yǎng)液（100 mL neurobasal-A＋2 mL B27＋252 μL 0.2 mol/LL-谷氨酰胺），之后每隔3 d換1/2體積培養(yǎng)液。在培養(yǎng)期間，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。

1.3.2 神經元的免疫熒光法鑒定

細胞爬片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L pH 7.4，下同）浸洗2 次，加入4%質量分數(shù)多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3 次，每次5 min。加3%山羊血清溫育30 min阻斷非特異性反應性，加入兔抗MAP-2（1∶200），并放入濕盒，在4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3 次后，加Cy3標記山羊抗小鼠IgG（1∶200），濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3 次，加入Hoechst 33258染色液，染色10 min，用PBS洗滌3 次。利用抗猝滅封片液封片，隨后在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 實驗分組、造模和干預

根據(jù)本課題組海馬神經元損傷模型方法[18]及預實驗結果，乳鼠原代海馬神經元細胞按1×106cells/mL濃度加入96 孔板中，按照實驗設計將細胞分為4 組：空白對照組、模型組、GS組和陽性對照EV組，除空白對照組外，其他組神經元加入含有Aβ25-35的培養(yǎng)基（30 μmol/L）孵育24 h，建立海馬神經元損傷模型；在造模前，GS和EV組分別用50 μmol/L金雀異黃酮和10 μmol/L EV預處理3 h，空白對照組加入新鮮神經元培養(yǎng)液100 μL。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 MTT法檢測海馬神經元存活率

神經元經過造模和干預后，于培養(yǎng)箱內孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，加PBS潤洗2 遍，每孔加入20 μL 5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT），孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔OD值。實驗重復3 次。按下式計算神經元存活率。

1.3.4.2 熒光探針檢測海馬神經元Ca2＋熒光強度

熒光探針fluo-3 AM用無Ca2＋細胞外液（135 mmol/L NaCl、2 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、4 g/L葡萄糖）稀釋成工作濃度5 μmol/L。神經元經過造模和干預后，孵育24 h，每孔加入1 mmol/L fluo-3 AM 5 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 次，流式細胞儀檢測細胞內Ca2＋熒光強度（以發(fā)出熒光細胞的比例計）。

1.3.4.3 Western blot測定海馬神經元相關蛋白的表達

神經元經過造模和干預后，孵育24 h，棄上清液，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白質量濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（CaM、CAMKK（1∶1 000）、p-CAMKIV（1∶800）、p-Tau（1∶600）），4 ℃過夜，Tris-HCl緩沖液（含1% Tween 20）洗滌3 次，加入山羊抗兔IgG（1∶20 000），室溫下孵育1.5 h，TBST洗滌3 次。使用電化學發(fā)光劑，凝膠成像儀拍照和半定量分析。實驗重復3 次。以β-actin作為內參。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

選用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較，方差齊采用最小顯著性差異（least significance difference，LSD）法，方差不齊采用Dunnett’s檢驗，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 原代海馬神經元的鑒定結果

免疫熒光法鑒定海馬神經元。微管相關蛋白-2（microtubule-associated protein，MAP-2）是一種神經系統(tǒng)的細胞骨架蛋白，在成熟和未成熟的神經元中都有表達，主要在樹突和細胞體中。MAP-2可以用來識別神經元。海馬神經元培養(yǎng)7 d后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，圖1A紅色熒光為MAP-2，圖1B顯示藍色熒光是被Hoechst 33258標記的細胞核，圖1C為圖1A和圖1B的疊加效果。檢測結果表明MAP-2蛋白陽性表達率為90%以上，海馬神經元細胞分離成功。

圖1 原代海馬神經元的鑒定結果Fig. 1 Identification of primary hippocampal neurons

2.2 金雀異黃酮對神經元損傷模型中神經元存活率的影響

MTT法檢測各組神經元存活率，結果見圖2。神經元經Aβ25-35處理后，模型組神經元存活率為50.4%，與空白對照組相比極顯著降低（P＜0.01），表明造模成功；GS組、陽性對照EV組神經元存活率分別為92.4%、73.1%，與模型組相比神經元存活率極顯著提高（P＜0.01）。

圖2 金雀異黃酮對神經元損傷模型中神經元存活率的影響Fig. 2 Effect of genistein on neuron survival rate in neuron injury model

2.3 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞Ca2＋熒光強度的影響

熒光探針技術檢測細胞內Ca2＋熒光強度。圖3結果顯示，與空白對照組比較，模型組神經元的Ca2＋綠色熒光強度極顯著提高（P＜0.01）；與模型組相比，GS組神經元Ca2＋綠色熒光強度極顯著降低（P＜0.01），陽性對照EV組神經元Ca2＋綠色熒光強度有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞Ca2＋熒光強度的影響Fig. 3 Effect of genistein on intracellular Ca2+ fluorescence intensity in neuron injury model

2.4 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達的影響

Western blot法檢測得到的Ca2＋-CaMKIV通路相關蛋白表達結果見圖4。與空白對照組比較，模型組神經元CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達極顯著升高；與模型組比較，GS和陽性對照EV組CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達極顯著降低（P＜0.01）。

圖4 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞相關蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of genistein on the expression of cell-related proteins in neuronal injury model

2.5 金雀異黃酮對神經元損傷模型中p-Tau蛋白表達的影響

Western blot法檢測p-Tau蛋白的表達結果見圖5。與空白對照組比較，模型組神經元p-Tau蛋白相對表達量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，GS和EV組p-Tau蛋白相對表達量極顯著降低（P＜0.01）。

圖5 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞p-Tau蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of genistein on the expression of p-Tau protein in neuronal injury model

3 討 論

AD是一種神經系統(tǒng)退行性疾病，海馬神經元的正常結構和功能受損是AD的一個重要病理基礎[19]。海馬區(qū)Aβ沉積是老年斑形成的關鍵因素，老年斑引起細胞內鈣離子超載和產生大量自由基，進而促進了Tau蛋白過度磷酸化和NFTs，導致海馬神經元和神經突觸丟失等病理改變[20-21]。金雀異黃酮是一種植物激素，富含于大豆類營養(yǎng)食品，近年來受到廣泛關注，具有改善更年期癥狀、預防骨質疏松、降低乳腺癌發(fā)病率等功效，在AD防治方面具有潛力。前期研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃酮可能通過下調半胱氨酸蛋白酶-3、Bcl-2相關X蛋白和細胞色素c表達，抑制線粒體凋亡，發(fā)揮神經保護作用[22]；可能通過抑制蛋白激酶C通路，減少氧化應激，降低細胞內Ca2＋水平，減少Aβ25-35對PC12細胞的神經毒性[23]。Aβ25-35為阿爾茨海默氏淀粉樣蛋白β肽鏈位于第25～35個氨基酸位點的基因片段，是引起神經毒性的主要活性部位，是目前研究體外復制神經元損傷模型的常用方法之一[24-25]。本實驗經免疫熒光鑒定結果表明，大鼠海馬神經元培養(yǎng)成功。Aβ25-35作用于大鼠原代海馬神經元24 h后經MTT檢測，結果顯示Aβ25-35誘導的海馬神經元存活率極顯著降低，神經元損傷模型成功建立；預先給予金雀異黃酮干預后，可減輕Aβ25-35所致神經元損傷，提高神經細胞存活率，提示金雀異黃酮對Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷模型具有很好的神經保護作用。

Ca2＋是體內最重要的元素之一，Ca2＋穩(wěn)態(tài)對于維持神經細胞的正常生理功能具有重要意義。Ca2＋超載出現(xiàn)在AD病程進展中甚至是AD病理改變早期[26]，Aβ的沉積和Tau蛋白磷酸化會引起細胞質和細胞核Ca2＋超載，進而激活一系列Ca2＋依賴性信號級聯(lián)反應。本實驗發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷模型Ca2＋熒光強度極顯著升高，金雀異黃酮預處理可極顯著降低神經元Ca2＋熒光強度，其可能原因是金雀異黃酮抑制了細胞膜上電壓依賴的Ca2＋通道，Ca2＋內流減少[27]，也可能是金雀異黃酮增強了Ca2＋誘導的Ca2＋-突觸結合蛋白等途徑的胞吐作用[28-29]，從而改善Ca2＋超載現(xiàn)象。

Ca2＋-CaMKIV信號通路在神經元傳遞、突出可塑性、神經細胞分化、認知功能等方面具有重要作用[30-31]。Ca2＋-CaMKIV信號通路涉及Ca2＋、CaM、CaMKK和CaMKIV。神經細胞過多的Ca2＋與CaM結合形成Ca2＋-CaM復合物，進而激活下游底物CaMKK，引起CaMKIV的磷酸化。磷酸化的CaMKIV一方面促進鈣依耐性突觸蛋白的磷酸化，導致突觸間囊泡運輸受阻，影響了新的突觸形成，損害了突觸功能；另一方面，CaMKIV過度磷酸化促使Tau蛋白Thr181、Thr231、Ser396等多個位點激活，促進Tau蛋白發(fā)生磷酸化。過度磷酸化的Tau蛋白由于不能與微管結合，容易引起自身聚集，進而形成雙股螺旋纖維，最終形成NFTs，導致神經元的死亡[16-17,32-33]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷模型CaM、CaMKK、p-CaMKIV以及p-Tau蛋白的表達均極顯著升高，而金雀異黃酮預處理可明顯減輕Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷，降低損傷神經元CaM、CaMKK、p-CaMKIV以及p-Tau蛋白的表達，提示金雀異黃酮可以下調Ca2＋-CaMKIV信號通路，減少Tau蛋白磷酸化。

綜上所述，金雀異黃酮可以減輕Aβ25-35對大鼠海馬神經元的損傷，其機制可能與減少Ca2＋超載、抑制Ca2＋-CaMKIV信號通路、減少tau蛋白磷酸化有關，但其作用機制仍需進一步深入研究，以為未來植物激素防治AD研究提供選擇。