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        (+)-兒茶素與表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂及氧化應(yīng)激的影響

        2021-07-29 03:26:56胡博然丁建才國(guó)鳳華
        食品科學(xué) 2021年13期
        關(guān)鍵詞:兒茶素存活率脂質(zhì)

        胡博然,丁建才,曹 楊,,田 穎,國(guó)鳳華,袁 靜

        (1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225127;2.首都兒科研究所,北京 100020;3.通化葡萄酒股份有限公司,吉林 通化 134002)

        隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,我國(guó)酒精飲料消費(fèi)快速增長(zhǎng),人均飲酒量大幅增加。過量飲酒對(duì)人體具有一定程度的損害,進(jìn)入人體的乙醇約有90%~95%在肝臟中代謝,乙醇對(duì)人體肝臟損害最為嚴(yán)重,這主要是乙醇及其衍生物在肝臟分解代謝過程中直接或間接誘導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而通過氧化應(yīng)激促使反應(yīng)性氧化物增加,誘發(fā)肝臟脂肪聚集[1-2]。

        兒茶素作為鞣質(zhì)的前體,廣泛分布于植物中,具有多種藥物活性成分,具有降血脂[3]、抗氧化[4]等的作用。(+)-兒茶素((+)-catechin,(+)-Cat)是兒茶素的異構(gòu)體之一,大多數(shù)研究集中在(+)-Cat的提取鑒定、提取方法改進(jìn)以及加工過程中兒茶素的穩(wěn)定性[5-7]方面,僅有少量文獻(xiàn)研究(+)-Cat在降血脂[8]方面的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是綠茶中含量最為豐富、性質(zhì)最為活潑的兒茶素類物質(zhì)[9]。王艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能有效改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠的脂代謝紊亂。Santamarina等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過調(diào)節(jié)肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物,增加能量消耗,特別是脂質(zhì)底物的氧化,從而有助于預(yù)防肝脂肪變性。大部分報(bào)道針對(duì)EGCG對(duì)于高脂膳食或糖尿病模型下的大鼠或小鼠血脂的影響,對(duì)乙醇誘導(dǎo)下細(xì)胞的脂代謝紊亂的研究鮮見報(bào)道。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇兒茶素單體中的基礎(chǔ)構(gòu)型(+)-Cat和兒茶素類物質(zhì)中抗氧化活性最強(qiáng)的單體EGCG,探究它們對(duì)乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激及脂代謝紊亂的作用,同時(shí)對(duì)比它們的差異,以期為兒茶素及兒茶素類物質(zhì)在功能性食品開發(fā)方面提供一定的參考。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞、材料與試劑

        HepG2肝癌細(xì)胞由中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心提供。

        (+)-Cat、EGCG 北京索萊寶科技有限公司;甘油三酯(triglycerides,TG)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        090-135.001倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司;Spectra Max i3x光譜掃描多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 乙醇作用濃度的確定

        根據(jù)前人研究結(jié)果[12-13],本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作用濃度為300 mmol/L。

        1.3.2 (+)-Cat、EGCG作用濃度的確定

        使用噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率[14]。96 孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后,按照濃度梯度分別向培養(yǎng)液中加入不同作用濃度(0、50、100、150、200、250、300 μmol/L)的(+)-Cat或EGCG,以不添加(+)-Cat或EGCG的正常培養(yǎng)基為對(duì)照組,每組6 個(gè)平行,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)細(xì)胞存活率以觀察(+)-Cat、EGCG對(duì)細(xì)胞的毒性。

        96 孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后,向培養(yǎng)液中加入不同作用濃度(0、50、100、150、200、250、300、350 μmol/L)的(+)-Cat或EGCG和300 mmol/L的乙醇,每組6 個(gè)平行,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)細(xì)胞存活率以觀察(+)-Cat、EGCG對(duì)抗乙醇毒性的作用。

        細(xì)胞存活率測(cè)定:向待測(cè)孔中加入50 μL 5mg/mL MTT,在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h,然后吸棄上清液,加入150 μL二甲基亞砜,置于搖床處理10 min后,在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

        結(jié)合以上兩組實(shí)驗(yàn)確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的(+)-Cat、EGCG作用濃度。

        1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

        確定(+)-Cat、EGCG作用濃度后,將實(shí)驗(yàn)分為6 組:正常組(培養(yǎng)基不添加(+)-Cat、EGCG和乙醇)、(+)-Cat組、EGCG組、乙醇作用組(ETOH組)、乙醇和(+)-Cat作用組((+)-Cat+ETOH組)、乙醇和EGCG作用組(EGCG+ETOH組)。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,(+)-Cat組、EGCG組、ETOH組分別在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)濃度的(+)-Cat、EGCG以及乙醇,培養(yǎng)24 h。(+)-Cat+ETOH、EGCG+ETOH組添加相應(yīng)濃度乙醇培養(yǎng)24 h后,分別加入相應(yīng)濃度的(+)-Cat、EGCG繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

        1.3.4 HepG2細(xì)胞TG含量、SOD活力、MDA濃度的檢測(cè)

        HepG2細(xì)胞TG含量、SOD活力、MDA濃度分別參考其試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.5 HepG2細(xì)胞脂代謝基因表達(dá)水平檢測(cè)

        使用TRIzol法抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后,使用SYBR Green染料法及CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增,采用2-ΔΔCT法計(jì)算各組HepG2細(xì)胞固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP-1)、二脂酰甘油轉(zhuǎn)移酶2(diacylglyceryltransferase 2,DGAT2)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisomal proliferators activate receptors α,PPARα)、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(carnityltransferase 1,CPT1)mRNA相對(duì)表達(dá)水平,相關(guān)基因引物序列詳見表1。

        表1 擴(kuò)增基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各組間平均值的兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 (+)-Cat、EGCG作用濃度的確定

        不同濃度的(+)-Cat和EGCG作用于HepG2細(xì)胞24 h后的細(xì)胞毒性如圖1A所示,200 μmol/L (+)-Cat和EGCG組細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著下降(P<0.05);250、300 μmol/L (+)-Cat和EGCG組細(xì)胞存活率較對(duì)照組極顯著下降(P<0.01),300 μmol/L EGCG已達(dá)到細(xì)胞的半數(shù)致死濃度;其余各組與對(duì)照組相比均無顯著變化(P>0.05)。

        圖1 MTT法檢測(cè)不同作用濃度(+)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effects of (+)-Cat and EGCG on HepG2 cell survival detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay

        (+)-Cat和EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞存活率的影響分別如圖1B、C所示,不同濃度的(+)-Cat和EGCG能夠減弱300 mmol/L乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。200、250 μmol/L (+)-Cat組細(xì)胞存活率極顯著高于300 mmol/L乙醇組(P<0.01);200 μmol/L EGCG組細(xì)胞存活率極顯著高于300 mmol/L乙醇組(P<0.01)。

        綜合(+)-Cat、EGCG對(duì)細(xì)胞的毒性作用以及二者抗乙醇毒性作用的結(jié)果,本研究選擇200 μmol/L作用濃度的(+)-Cat和EGCG分析(+)-Cat和EGCG對(duì)脂代謝紊亂和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)效果并比較二者的差異。

        2.2 (+)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞TG含量的影響

        如表2所示,與正常組相比,(+)-Cat組及EGCG組的TG含量無顯著差異(P>0.05),ETOH組TG含量顯著上升(P<0.05),說明在乙醇的作用下,HepG2細(xì)胞脂代謝異常,造成TG的堆積。與ETOH組相比,(+)-Cat+ETOH組、EGCG+ETOH組的TG平均含量顯著降低(P<0.05),分別為ETOH組的63%和44%,說明(+)-Cat與EGCG有效緩解了脂質(zhì)堆積,且EGCG的效果更好。

        表2 (+)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞TG含量的影響Table 2 Effects of (+)-Cat and EGCG on TG content in HepG2 cells

        2.3 油紅O染色觀察(+)-Cat與EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂滴的影響

        通過油紅O染色可以直接觀察出細(xì)胞胞漿中脂滴的狀態(tài)。由圖2可知,ETOH組與正常組、(+)-Cat組和EGCG組相比,可見較多的斑點(diǎn)狀紅色脂滴,說明乙醇誘導(dǎo)后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)積累;(+)-Cat+ETOH組和EGCG+ETOH組與ETOH組相比,脂滴明顯減少,說明(+)-Cat和EGCG的干預(yù)均可減輕乙醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積。油紅O染色結(jié)果與TG含量檢測(cè)結(jié)果較為一致。Wu Qiong等[15]研究發(fā)現(xiàn),EGCG在一定甘油的作用下能抑制細(xì)胞內(nèi)的抑制3-羥基-3-甲基戊二?;o酶a還原酶活性,降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇。Laura等[16]測(cè)試了郝靈普洱茶提取物和茶的主要成分EGCG對(duì)大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的降脂效果,發(fā)現(xiàn)EGCG具有體外降脂作用。Roghani等[17]觀察慢性給藥EGCG對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病大鼠脂質(zhì)和肝脂質(zhì)過氧化的影響,得出慢性EGCG治療糖尿病大鼠,可防止血糖和脂質(zhì)異常變化,降低肝脂質(zhì)過氧化。張聰?shù)萚3]以油酸孵育HepG2細(xì)胞24 h,建立體外高脂模型,在MTT實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以脂質(zhì)清除率為指標(biāo),評(píng)價(jià)兒茶素的體外降脂效果,發(fā)現(xiàn)兒茶素能有效清除肝細(xì)胞內(nèi)堆積的脂肪,與本研究中的結(jié)果一致。

        圖2 油紅O染色觀察(+)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂滴的影響(200×)Fig. 2 Oil red O staining observation of the effect of (+)-Cat and EGCG on lipid droplets in HepG2 cells (200 ×)

        2.4 (+)-Cat與EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝基因表達(dá)水平的影響

        由圖3可知,與正常組相比,ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01,P<0.05),分別為正常組的1.8 倍和1.4 倍;PPARα與CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05,P<0.01),分別為正常組的30%和20%,說明乙醇影響了HepG2細(xì)胞脂代謝基因的正常表達(dá)。與ETOH組相比,(+)-Cat+ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),均約為ETOH組的80%;PPARα與CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05、P<0.01),分別為ETOH組的2.4 倍和3.3 倍;EGCG+ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)分別為ETOH組的69%和75%;PPARα與CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)分別為ETOH組的2.1 倍和2.8 倍。說明(+)-Cat和EGCG均能通過調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),對(duì)乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂具有恢復(fù)作用,在相同濃度條件下EGCG的恢復(fù)效果更好。

        圖3 (+)-Cat、EGCG對(duì) HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of (+)-Cat and EGCG on the expression of lipid metabolism-related genes in HepG2 cells

        2.5 (+)-Cat與EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化酶SOD活力和脂質(zhì)過氧化物MDA濃度的影響

        如表3所示,與正常組相比,EGCG組SOD活力顯著增加(P<0.05),MDA濃度無顯著變化(P>0.05)。ETOH組較正常組的SOD活力顯著降低(P<0.05),為正常組的42%;MDA濃度顯著增加(P<0.05),為正常組的1.7 倍。研究表明,過量飲酒導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡,產(chǎn)生大量的活性氧,經(jīng)過脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生MDA,當(dāng)MDA在機(jī)體內(nèi)上升時(shí)SOD清除自由基的能力相對(duì)下降[18]。ETOH組SOD活力降低、MDA濃度增加驗(yàn)證了這一結(jié)論。(+)-Cat+ETOH組與EGCG+ETOH組較ETOH組的MDA濃度顯著降低(P<0.05),分別為ETOH組的37%和23%,SOD活力顯著提高(P<0.05),分別為ETOH組的1.2 倍和1.4 倍。綜上可知(+)-Cat、EGCG干預(yù)后可改善細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài),增強(qiáng)抗氧化酶活性、減弱脂質(zhì)過氧化,其中EGCG的效果更好。

        表3 (+)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞SOD活力和MDA濃度的影響Table 3 Effects of (+)-Cat and EGCG on SOD activity and MDA content in HepG2 cells

        3 討 論

        DGAT有兩個(gè)亞型(DGAT1與DGAT2),DGAT1主要負(fù)責(zé)組裝TG,DGAT2通過促進(jìn)二?;视秃烷L(zhǎng)鏈脂肪酰基輔酶A的鍵合來催化TG合成最后一步[19]。相對(duì)于DGAT1,DGAT2的表達(dá)在TG的合成中占有更重要的地位。初欣欣等[20]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后的金黃地鼠肝臟中,DGAT2基因表達(dá)量明顯升高,使得肝臟組織利用脂肪酸合成TG,使肝臟中TG的含量升高。宋芳等[21]研究發(fā)現(xiàn)乙醇誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠中DGATmRNA的表達(dá)量明顯升高。本實(shí)驗(yàn)中ETOH組細(xì)胞TG含量明顯高于正常組(P<0.05),與乙醇誘導(dǎo)后細(xì)胞DGAT2mRNA的表達(dá)量升高有一定關(guān)系。(+)-Cat、EGCG干預(yù)組TG含量較ETOH組低,說明(+)-Cat、EGCG干預(yù)后下調(diào)DGAT2mRNA的表達(dá),對(duì)降低TG合成起到了一定作用。

        酒精性脂肪肝在組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)為以TG為代表的中性脂肪在胞質(zhì)中大量蓄積。研究表明,酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與腺苷酸蛋白活化激酶腺苷酸蛋白活化激酶介導(dǎo)的脂代謝通路受阻緊密相關(guān)。乙醇及其代謝產(chǎn)生的乙醛和活性氧等有害代謝物會(huì)不同程度地抑制肝臟腺苷酸蛋白活化激酶的活性,進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸合成,抑制脂肪酸氧化,最終引起脂肪變性。SREBPs是肝臟中調(diào)節(jié)脂肪酸、TG和膽固醇的主要轉(zhuǎn)錄因子,包括3 種亞型(SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2)[22]。SREBP-1的過量表達(dá)會(huì)促進(jìn)脂肪酸、TG的合成[23]。近年研究發(fā)現(xiàn),EGCG能夠激活腺苷酸蛋白活化激酶[24],而腺苷酸蛋白活化激酶的激活可以抑制SPEBP-1信號(hào)的傳導(dǎo)[25],從而降低SREBP-1mRNA的表達(dá)量,減少TG的合成。本實(shí)驗(yàn)中EGCG干預(yù)組的SREBP-1mRNA表達(dá)量、TG含量較ETOH組低,與EGCG能夠激活腺苷酸蛋白活化激酶有關(guān)。(+)-Cat干預(yù)組對(duì)下調(diào)SREBP-1mRNA的表達(dá),減少TG的合成也有一定作用,但效果沒有EGCG干預(yù)組明顯。

        過氧化物酶體增殖物激活受體對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝有著重要的作用。PPARα是過氧化物酶體增殖物激活受體的亞型之一,能夠調(diào)節(jié)TG和脂肪酸氧化階段,促進(jìn)脂肪酸向線粒體和過氧化物酶方向流動(dòng),促進(jìn)脂肪酸氧化[26]。CPT1是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶。PPARα的表達(dá)可以促進(jìn)脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶CPT1的表達(dá),使得肝細(xì)胞脂肪酸氧化速率加快[27-28]。本研究中(+)-Cat、EGCG干預(yù)組的PPARα和CPT1mRNA的表達(dá)量都較ETOH組高,同時(shí)干預(yù)組的TG含量較ETOH組低,說明(+)-Cat、EGCG能上調(diào)PPARα和CPT1mRNA的表達(dá),加快脂質(zhì)氧化。

        研究表明細(xì)胞正常生理代謝過程中獲取的氧,98%轉(zhuǎn)化為能量,2%轉(zhuǎn)化為氧自由基,正常情況下體內(nèi)的天然抗氧化劑(SOD、谷胱甘肽等)會(huì)與氧自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng),清除自由基,但長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)打破這一動(dòng)態(tài)平衡,導(dǎo)致氧自由基大量增多,抗氧化物質(zhì)耗竭[29]。茶多酚被證實(shí)是有效的自由基清除劑,其中EGCG的還原電勢(shì)較低,抗氧化能力較強(qiáng)[30]。綠茶中的兒茶素尤其是EGCG能夠抑制活性氧的產(chǎn)生,達(dá)到抗氧化目的[31-32]。本研究中(+)-Cat和EGCG均對(duì)乙醇誘導(dǎo)下細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用,且EGCG的干預(yù)效果更好,但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

        本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)乙醇誘導(dǎo)下HepG2細(xì)胞損傷,(+)-Cat、EGCG均能降低TG和脂肪酸合成相關(guān)基因SREBP-1、DGAT2的表達(dá),減少TG的合成;增加HepG2細(xì)胞中脂肪酸氧化基因PPARα和CPT1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞脂肪酸氧化,減少脂質(zhì)積累;提高SOD活性,降低MDA濃度,改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)下HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于(+)-Cat。

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