胡博然，丁建才，曹 楊,，田 穎，國(guó)鳳華，袁 靜

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.首都兒科研究所，北京 100020；3.通化葡萄酒股份有限公司，吉林 通化 134002）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)酒精飲料消費(fèi)快速增長(zhǎng)，人均飲酒量大幅增加。過(guò)量飲酒對(duì)人體具有一定程度的損害，進(jìn)入人體的乙醇約有90%～95%在肝臟中代謝，乙醇對(duì)人體肝臟損害最為嚴(yán)重，這主要是乙醇及其衍生物在肝臟分解代謝過(guò)程中直接或間接誘導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)氧化應(yīng)激促使反應(yīng)性氧化物增加，誘發(fā)肝臟脂肪聚集[1-2]。

兒茶素作為鞣質(zhì)的前體，廣泛分布于植物中，具有多種藥物活性成分，具有降血脂[3]、抗氧化[4]等的作用。(＋)-兒茶素（(＋)-catechin，(＋)-Cat）是兒茶素的異構(gòu)體之一，大多數(shù)研究集中在(＋)-Cat的提取鑒定、提取方法改進(jìn)以及加工過(guò)程中兒茶素的穩(wěn)定性[5-7]方面，僅有少量文獻(xiàn)研究(＋)-Cat在降血脂[8]方面的作用。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中含量最為豐富、性質(zhì)最為活潑的兒茶素類(lèi)物質(zhì)[9]。王艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能有效改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠的脂代謝紊亂。Santamarina等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物，增加能量消耗，特別是脂質(zhì)底物的氧化，從而有助于預(yù)防肝脂肪變性。大部分報(bào)道針對(duì)EGCG對(duì)于高脂膳食或糖尿病模型下的大鼠或小鼠血脂的影響，對(duì)乙醇誘導(dǎo)下細(xì)胞的脂代謝紊亂的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇兒茶素單體中的基礎(chǔ)構(gòu)型(＋)-Cat和兒茶素類(lèi)物質(zhì)中抗氧化活性最強(qiáng)的單體EGCG，探究它們對(duì)乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激及脂代謝紊亂的作用，同時(shí)對(duì)比它們的差異，以期為兒茶素及兒茶素類(lèi)物質(zhì)在功能性食品開(kāi)發(fā)方面提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料與試劑

HepG2肝癌細(xì)胞由中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心提供。

(＋)-Cat、EGCG 北京索萊寶科技有限公司；甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

090-135.001倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司；Spectra Max i3x光譜掃描多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇作用濃度的確定

根據(jù)前人研究結(jié)果[12-13]，本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作用濃度為300 mmol/L。

1.3.2 (＋)-Cat、EGCG作用濃度的確定

使用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率[14]。96 孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)板底后，按照濃度梯度分別向培養(yǎng)液中加入不同作用濃度（0、50、100、150、200、250、300 μmol/L）的(＋)-Cat或EGCG，以不添加(＋)-Cat或EGCG的正常培養(yǎng)基為對(duì)照組，每組6 個(gè)平行，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)細(xì)胞存活率以觀察(＋)-Cat、EGCG對(duì)細(xì)胞的毒性。

96 孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)板底后，向培養(yǎng)液中加入不同作用濃度（0、50、100、150、200、250、300、350 μmol/L）的(＋)-Cat或EGCG和300 mmol/L的乙醇，每組6 個(gè)平行，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)細(xì)胞存活率以觀察(＋)-Cat、EGCG對(duì)抗乙醇毒性的作用。

細(xì)胞存活率測(cè)定：向待測(cè)孔中加入50 μL 5mg/mL MTT，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后吸棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床處理10 min后，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

結(jié)合以上兩組實(shí)驗(yàn)確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的(＋)-Cat、EGCG作用濃度。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

確定(＋)-Cat、EGCG作用濃度后，將實(shí)驗(yàn)分為6 組：正常組（培養(yǎng)基不添加(＋)-Cat、EGCG和乙醇）、(＋)-Cat組、EGCG組、乙醇作用組（ETOH組）、乙醇和(＋)-Cat作用組（(＋)-Cat＋ETOH組）、乙醇和EGCG作用組（EGCG＋ETOH組）。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，(＋)-Cat組、EGCG組、ETOH組分別在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)濃度的(＋)-Cat、EGCG以及乙醇，培養(yǎng)24 h。(＋)-Cat＋ETOH、EGCG＋ETOH組添加相應(yīng)濃度乙醇培養(yǎng)24 h后，分別加入相應(yīng)濃度的(＋)-Cat、EGCG繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 HepG2細(xì)胞TG含量、SOD活力、MDA濃度的檢測(cè)

HepG2細(xì)胞TG含量、SOD活力、MDA濃度分別參考其試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 HepG2細(xì)胞脂代謝基因表達(dá)水平檢測(cè)

使用TRIzol法抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，使用SYBR Green染料法及CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用2－ΔΔCT法計(jì)算各組HepG2細(xì)胞固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP-1）、二脂酰甘油轉(zhuǎn)移酶2（diacylglyceryltransferase 2，DGAT2）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisomal proliferators activate receptors α，PPARα）、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1（carnityltransferase 1，CPT1）mRNA相對(duì)表達(dá)水平，相關(guān)基因引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間平均值的兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 (＋)-Cat、EGCG作用濃度的確定

不同濃度的(＋)-Cat和EGCG作用于HepG2細(xì)胞24 h后的細(xì)胞毒性如圖1A所示，200 μmol/L (＋)-Cat和EGCG組細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）；250、300 μmol/L (＋)-Cat和EGCG組細(xì)胞存活率較對(duì)照組極顯著下降（P＜0.01），300 μmol/L EGCG已達(dá)到細(xì)胞的半數(shù)致死濃度；其余各組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

圖1 MTT法檢測(cè)不同作用濃度(＋)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effects of (+)-Cat and EGCG on HepG2 cell survival detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay

(＋)-Cat和EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞存活率的影響分別如圖1B、C所示，不同濃度的(＋)-Cat和EGCG能夠減弱300 mmol/L乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。200、250 μmol/L (＋)-Cat組細(xì)胞存活率極顯著高于300 mmol/L乙醇組（P＜0.01）；200 μmol/L EGCG組細(xì)胞存活率極顯著高于300 mmol/L乙醇組（P＜0.01）。

綜合(＋)-Cat、EGCG對(duì)細(xì)胞的毒性作用以及二者抗乙醇毒性作用的結(jié)果，本研究選擇200 μmol/L作用濃度的(＋)-Cat和EGCG分析(＋)-Cat和EGCG對(duì)脂代謝紊亂和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)效果并比較二者的差異。

2.2 (＋)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞TG含量的影響

如表2所示，與正常組相比，(＋)-Cat組及EGCG組的TG含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），ETOH組TG含量顯著上升（P＜0.05），說(shuō)明在乙醇的作用下，HepG2細(xì)胞脂代謝異常，造成TG的堆積。與ETOH組相比，(＋)-Cat＋ETOH組、EGCG＋ETOH組的TG平均含量顯著降低（P＜0.05），分別為ETOH組的63%和44%，說(shuō)明(＋)-Cat與EGCG有效緩解了脂質(zhì)堆積，且EGCG的效果更好。

表2 (＋)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞TG含量的影響Table 2 Effects of (+)-Cat and EGCG on TG content in HepG2 cells

2.3 油紅O染色觀察(＋)-Cat與EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂滴的影響

通過(guò)油紅O染色可以直接觀察出細(xì)胞胞漿中脂滴的狀態(tài)。由圖2可知，ETOH組與正常組、(＋)-Cat組和EGCG組相比，可見(jiàn)較多的斑點(diǎn)狀紅色脂滴，說(shuō)明乙醇誘導(dǎo)后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)積累；(＋)-Cat＋ETOH組和EGCG＋ETOH組與ETOH組相比，脂滴明顯減少，說(shuō)明(＋)-Cat和EGCG的干預(yù)均可減輕乙醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積。油紅O染色結(jié)果與TG含量檢測(cè)結(jié)果較為一致。Wu Qiong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在一定甘油的作用下能抑制細(xì)胞內(nèi)的抑制3-羥基-3-甲基戊二?；o酶a還原酶活性，降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇。Laura等[16]測(cè)試了郝靈普洱茶提取物和茶的主要成分EGCG對(duì)大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的降脂效果，發(fā)現(xiàn)EGCG具有體外降脂作用。Roghani等[17]觀察慢性給藥EGCG對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病大鼠脂質(zhì)和肝脂質(zhì)過(guò)氧化的影響，得出慢性EGCG治療糖尿病大鼠，可防止血糖和脂質(zhì)異常變化，降低肝脂質(zhì)過(guò)氧化。張聰?shù)萚3]以油酸孵育HepG2細(xì)胞24 h，建立體外高脂模型，在MTT實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)清除率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)兒茶素的體外降脂效果，發(fā)現(xiàn)兒茶素能有效清除肝細(xì)胞內(nèi)堆積的脂肪，與本研究中的結(jié)果一致。

圖2 油紅O染色觀察(＋)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂滴的影響（200×）Fig. 2 Oil red O staining observation of the effect of (+)-Cat and EGCG on lipid droplets in HepG2 cells (200 ×)

2.4 (＋)-Cat與EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝基因表達(dá)水平的影響

由圖3可知，與正常組相比，ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），分別為正常組的1.8 倍和1.4 倍；PPARα與CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），分別為正常組的30%和20%，說(shuō)明乙醇影響了HepG2細(xì)胞脂代謝基因的正常表達(dá)。與ETOH組相比，(＋)-Cat＋ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），均約為ETOH組的80%；PPARα與CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05、P＜0.01），分別為ETOH組的2.4 倍和3.3 倍；EGCG＋ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）分別為ETOH組的69%和75%；PPARα與CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）分別為ETOH組的2.1 倍和2.8 倍。說(shuō)明(＋)-Cat和EGCG均能通過(guò)調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂具有恢復(fù)作用，在相同濃度條件下EGCG的恢復(fù)效果更好。

圖3 (＋)-Cat、EGCG對(duì) HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of (+)-Cat and EGCG on the expression of lipid metabolism-related genes in HepG2 cells

2.5 (＋)-Cat與EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化酶SOD活力和脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA濃度的影響

如表3所示，與正常組相比，EGCG組SOD活力顯著增加（P＜0.05），MDA濃度無(wú)顯著變化（P＞0.05）。ETOH組較正常組的SOD活力顯著降低（P＜0.05），為正常組的42%；MDA濃度顯著增加（P＜0.05），為正常組的1.7 倍。研究表明，過(guò)量飲酒導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量的活性氧，經(jīng)過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用產(chǎn)生MDA，當(dāng)MDA在機(jī)體內(nèi)上升時(shí)SOD清除自由基的能力相對(duì)下降[18]。ETOH組SOD活力降低、MDA濃度增加驗(yàn)證了這一結(jié)論。(＋)-Cat＋ETOH組與EGCG＋ETOH組較ETOH組的MDA濃度顯著降低（P＜0.05），分別為ETOH組的37%和23%，SOD活力顯著提高（P＜0.05），分別為ETOH組的1.2 倍和1.4 倍。綜上可知(＋)-Cat、EGCG干預(yù)后可改善細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)抗氧化酶活性、減弱脂質(zhì)過(guò)氧化，其中EGCG的效果更好。

表3 (＋)-Cat、EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞SOD活力和MDA濃度的影響Table 3 Effects of (+)-Cat and EGCG on SOD activity and MDA content in HepG2 cells

3 討 論

DGAT有兩個(gè)亞型（DGAT1與DGAT2），DGAT1主要負(fù)責(zé)組裝TG，DGAT2通過(guò)促進(jìn)二?；视秃烷L(zhǎng)鏈脂肪?；o酶A的鍵合來(lái)催化TG合成最后一步[19]。相對(duì)于DGAT1，DGAT2的表達(dá)在TG的合成中占有更重要的地位。初欣欣等[20]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后的金黃地鼠肝臟中，DGAT2基因表達(dá)量明顯升高，使得肝臟組織利用脂肪酸合成TG，使肝臟中TG的含量升高。宋芳等[21]研究發(fā)現(xiàn)乙醇誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠中DGATmRNA的表達(dá)量明顯升高。本實(shí)驗(yàn)中ETOH組細(xì)胞TG含量明顯高于正常組（P＜0.05），與乙醇誘導(dǎo)后細(xì)胞DGAT2mRNA的表達(dá)量升高有一定關(guān)系。(＋)-Cat、EGCG干預(yù)組TG含量較ETOH組低，說(shuō)明(＋)-Cat、EGCG干預(yù)后下調(diào)DGAT2mRNA的表達(dá)，對(duì)降低TG合成起到了一定作用。

酒精性脂肪肝在組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)為以TG為代表的中性脂肪在胞質(zhì)中大量蓄積。研究表明，酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與腺苷酸蛋白活化激酶腺苷酸蛋白活化激酶介導(dǎo)的脂代謝通路受阻緊密相關(guān)。乙醇及其代謝產(chǎn)生的乙醛和活性氧等有害代謝物會(huì)不同程度地抑制肝臟腺苷酸蛋白活化激酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸合成，抑制脂肪酸氧化，最終引起脂肪變性。SREBPs是肝臟中調(diào)節(jié)脂肪酸、TG和膽固醇的主要轉(zhuǎn)錄因子，包括3 種亞型（SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2）[22]。SREBP-1的過(guò)量表達(dá)會(huì)促進(jìn)脂肪酸、TG的合成[23]。近年研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠激活腺苷酸蛋白活化激酶[24]，而腺苷酸蛋白活化激酶的激活可以抑制SPEBP-1信號(hào)的傳導(dǎo)[25]，從而降低SREBP-1mRNA的表達(dá)量，減少TG的合成。本實(shí)驗(yàn)中EGCG干預(yù)組的SREBP-1mRNA表達(dá)量、TG含量較ETOH組低，與EGCG能夠激活腺苷酸蛋白活化激酶有關(guān)。(＋)-Cat干預(yù)組對(duì)下調(diào)SREBP-1mRNA的表達(dá)，減少TG的合成也有一定作用，但效果沒(méi)有EGCG干預(yù)組明顯。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝有著重要的作用。PPARα是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的亞型之一，能夠調(diào)節(jié)TG和脂肪酸氧化階段，促進(jìn)脂肪酸向線粒體和過(guò)氧化物酶方向流動(dòng)，促進(jìn)脂肪酸氧化[26]。CPT1是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶。PPARα的表達(dá)可以促進(jìn)脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶CPT1的表達(dá)，使得肝細(xì)胞脂肪酸氧化速率加快[27-28]。本研究中(＋)-Cat、EGCG干預(yù)組的PPARα和CPT1mRNA的表達(dá)量都較ETOH組高，同時(shí)干預(yù)組的TG含量較ETOH組低，說(shuō)明(＋)-Cat、EGCG能上調(diào)PPARα和CPT1mRNA的表達(dá)，加快脂質(zhì)氧化。

研究表明細(xì)胞正常生理代謝過(guò)程中獲取的氧，98%轉(zhuǎn)化為能量，2%轉(zhuǎn)化為氧自由基，正常情況下體內(nèi)的天然抗氧化劑（SOD、谷胱甘肽等）會(huì)與氧自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，清除自由基，但長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)打破這一動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致氧自由基大量增多，抗氧化物質(zhì)耗竭[29]。茶多酚被證實(shí)是有效的自由基清除劑，其中EGCG的還原電勢(shì)較低，抗氧化能力較強(qiáng)[30]。綠茶中的兒茶素尤其是EGCG能夠抑制活性氧的產(chǎn)生,達(dá)到抗氧化目的[31-32]。本研究中(＋)-Cat和EGCG均對(duì)乙醇誘導(dǎo)下細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用，且EGCG的干預(yù)效果更好，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)乙醇誘導(dǎo)下HepG2細(xì)胞損傷，(＋)-Cat、EGCG均能降低TG和脂肪酸合成相關(guān)基因SREBP-1、DGAT2的表達(dá)，減少TG的合成；增加HepG2細(xì)胞中脂肪酸氧化基因PPARα和CPT1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞脂肪酸氧化，減少脂質(zhì)積累；提高SOD活性，降低MDA濃度，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)下HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于(＋)-Cat。