周賽楠，張 青，王發(fā)合，王曉梅，李兆杰，薛長(zhǎng)湖,3，唐慶娟,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.青島明月海藻集團(tuán)有限公司，海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266400；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237）

如今超重和肥胖成為一種全球性的“流行病”，中國(guó)已成為世界上肥胖人口最多的國(guó)家[1]。肥胖使人易患冠心病[2]、高血壓[3]、內(nèi)分泌及代謝性疾病[4]。肥胖者患病率比常人高，如患糖尿病的概率約為常人的5 倍[5]。部分肥胖患者服用減肥和降脂藥來(lái)達(dá)到減肥降脂的目的，然而這些藥物都具有較為明顯的副作用，如運(yùn)用最多的減肥藥奧利司他會(huì)導(dǎo)致服用者體內(nèi)脂溶性維生素缺乏[6]、肝臟損傷[7]、形成油性便[8]。他汀類降脂藥物會(huì)損害人體肌肉和肝臟[9]。這些藥物不能滿足如今人類對(duì)健康的要求。因此，研發(fā)輔助減肥、降糖降脂的綠色天然健康食品及配方來(lái)代替減肥降脂藥物是食品科學(xué)與人類健康領(lǐng)域的重要研究課題之一，也是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)海洋生物資源漸漸被開(kāi)發(fā)利用。海藻產(chǎn)量豐富、易獲得，是一種具有食藥兩用價(jià)值的海洋生物資源[10]。來(lái)自海藻的許多天然產(chǎn)物具有抗炎、降血脂、降血糖等活性[11]。羊棲菜（Sargassum fusiforme）是褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬植物，在我國(guó)沿海地帶均有分布，是一種低脂低熱、高蛋白、高膳食纖維和富含礦物元素的天然食品[12]。研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜具有抗氧化、抗癌和減肥等功效[13]。與此同時(shí)，對(duì)果蔬中天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用也越來(lái)越多。從姜科植物姜黃中提取的姜黃素是一種常見(jiàn)的食用色素，具有抗氧化、抗炎等功能，還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝[14]。從石榴皮中提取的多酚物質(zhì)安石榴苷在抗炎抗癌等方面具有重要作用，同時(shí)也具有降脂減肥的功效[15]。這些海藻、果蔬來(lái)源的天然產(chǎn)物安全無(wú)毒、無(wú)害、社會(huì)認(rèn)可度高[16]。利用上述海藻、果蔬開(kāi)發(fā)輔助降糖降脂的綠色天然健康食品及配方對(duì)自然資源開(kāi)發(fā)利用和人類健康都具有重要意義。

從天然產(chǎn)物中篩選糖脂代謝關(guān)鍵酶抑制劑，是開(kāi)發(fā)輔助降糖降脂食品的有效途徑[17]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶，將淀粉、蔗糖等水解為單糖后被吸收進(jìn)入血液[18]。胰脂肪酶是人體脂質(zhì)消化的關(guān)鍵酶，能夠?qū)⒅|(zhì)大分子分解成小分子、形成乳糜微粒吸收入腸[19]。精準(zhǔn)靶向抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性，可抑制葡萄糖和脂質(zhì)的吸收，控制血糖[20]、減少脂質(zhì)攝入[21]。Wang等[22]使用響應(yīng)面法以α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-4的體外抑制活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化配方，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示配方能顯著降低肥胖小鼠的血糖水平，改善了糖耐量。由此可知消化代謝酶抑制活性可以作為配方設(shè)計(jì)的依據(jù)[23]。因此本實(shí)驗(yàn)以羊棲菜水提物為主，姜黃、石榴提取物（姜黃素、安石榴苷）為輔，以體外α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制率為依據(jù)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的配方，為開(kāi)發(fā)輔助降糖降脂的保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜（Sargassum fusiforme）采摘自浙江溫州沿海。

α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖（純度≥98%）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside，PNPG）、奧利司他（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；豬胰脂肪酶、4-甲基傘形酮油酸酯（4-methylumbelliferyl oleate，4-MUO）美國(guó)Sigma公司；姜黃素（純度95%） 河北天旭生物科技有限公司；安石榴苷（純度98%） 四川維克奇生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GIPP-4000FD真空冷凍干燥機(jī) 上海繼譜電子科技有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；MR-23i型高速冷凍離心機(jī) 法國(guó)Jouan公司；MB100-4A微孔板恒溫孵育器 常州邁科諾儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Sunrisebasic酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 羊棲菜水提物制備

將真空冷凍干燥的羊棲菜樣品室溫下水中浸泡10 h，研磨粉碎，以料液比1∶50將羊棲菜粉末與蒸餾水混合均勻，85 ℃水浴攪拌6 h[24]。將提取液在室溫下以4 500 r/min離心15 min，隨后收集上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，至冷凝管無(wú)水滴流下時(shí)轉(zhuǎn)移到恒溫箱中35 ℃烘干，獲得的干燥粉末即為羊棲菜水提物。

1.3.2α-葡萄糖苷酶活力測(cè)定

采用PNPG比色法進(jìn)行測(cè)定，參考文獻(xiàn)[25]并稍作修改。測(cè)定原理為α-葡萄糖苷酶與PNPG底物反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生有色物質(zhì)。用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）溶解樣品（各單獨(dú)的配方組分、復(fù)合配方組分）得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。實(shí)驗(yàn)在96 孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，20 μL樣品溶液與20 μL 2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育15 min，向其中加入20 μL 20 mmol/L PNPG溶液（溶劑為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液），37 ℃孵育10 min，再加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定體系在405 nm波長(zhǎng)處的吸光度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)組：樣品組、背景組（蒸餾水代替酶溶液）、空白組（蒸餾水代替樣品溶液）。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)式（1）計(jì)算α-葡萄糖苷酶活力抑制率。

式中：A0為空白組吸光度；A1為背景組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.3.3 胰脂肪酶活力測(cè)定

胰脂肪酶活力測(cè)定的原理為胰脂肪酶降解4-MUO生成具有熒光吸收的產(chǎn)物4-甲基傘形酮[26]。樣品（各單獨(dú)的配方組分、復(fù)合配方組分）用二甲基亞砜助溶后用Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。0.5 mg豬胰脂肪酶粉末溶解在1 mL Tris-HCl緩沖液中。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。25 μL樣品溶液與25 μL胰脂肪酶溶液混合后加入96 孔板中，預(yù)孵育10 min后，向其中加入50 μL 4-MUO啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min后使用酶標(biāo)儀讀取激發(fā)波長(zhǎng)360 nm、發(fā)射波長(zhǎng)465 nm處體系熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)組：樣品組、背景組（蒸餾水代替酶溶液）、空白組（蒸餾水代替樣品溶液）。按式（1）計(jì)算胰脂肪酶活力抑制率。

1.3.4 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗(yàn)

以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷為配方組分，設(shè)計(jì)以羊棲菜水提物為主，姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方。以3 個(gè)組分對(duì)2 種酶活力的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）平均值為各組分配比的確定依據(jù)[27]，確定各組分質(zhì)量比例范圍。以0.5 mg/mL復(fù)合配方對(duì)2 種酶的活力抑制率為指標(biāo)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)單因素試驗(yàn)中兩個(gè)固定因素的配比，進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗(yàn)，確定各組分最佳配比。

1.3.4.1 羊棲菜水提物配比對(duì)復(fù)配配方抑制酶活性的影響

固定m（姜黃素）∶m（安石榴苷）＝4∶2（定義配比為混合物中各成分質(zhì)量比的數(shù)值，比如此處姜黃素、安石榴苷的配比分別為4、2），改變羊棲菜水提物的配比，分別為150、450、750、1 050、1 350，以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率為指標(biāo)，判定羊棲菜水提物最佳配比。

1.3.4.2 姜黃素配比對(duì)復(fù)配配方抑制酶活性的影響

固定羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比分別為450和2，改變姜黃素的配比，分別為2、4、6、8、10，以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對(duì)2 種酶活力的抑制率為指標(biāo)，判定姜黃素最佳配比。

1.3.4.3 安石榴苷配比對(duì)復(fù)配配方抑制酶活性的影響

確定羊棲菜水提物配比和姜黃素配比分別為450和4，改變安石榴苷的配比，分別為1、2、3、4、5，以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對(duì)2 種酶活力的抑制率為指標(biāo)，判定安石榴苷最佳配比。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化海藻果蔬提取物復(fù)配配方

以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷的配比為3 個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平（單因素篩選出），總質(zhì)量濃度是0.5 mg/mL，以配方對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性的抑制率為響應(yīng)值，響應(yīng)值越大，配比效果越好，用響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析[28]，確定各成分配比。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Independent variables and their coded and actual levels used for response surface design

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果以表示。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方組分對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率

圖1比較了配方組分對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50，IC50越小抑制效果越好。安石榴苷對(duì)兩種酶的抑制效果明顯強(qiáng)于其他成分，其對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別是（0.420 0±0.001 3）mg/mL和（0.090 0±0.010 9）mg/mL；姜黃素的抑制效果次之，其IC50分別是（0.730 0±0.018 6）mg/mL和（0.740 0±0.028 6）mg/mL；羊棲菜水提物的抑制效果相對(duì)較弱，其IC50分別是（38.22±1.57）mg/mL和（1.02±0.02）mg/mL。3 個(gè)組分（羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷）對(duì)兩種酶活力的IC50平均值之比約為150∶6∶2。以此比值為依據(jù)，確定各組分配比范圍，即羊棲菜水提物配比：150、450、750、1 050、1 350；姜黃素配比：2、4、6、8、10；安石榴苷配比：1、2、3、4、5。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化以羊棲菜水提物為主，姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方，首先進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗(yàn)。

圖1 配方組分對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50Fig. 1 IC50 values for inhibition of α-glucosidase and pancreatic lipase by formulation ingredients

2.2 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖2A所示，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下，配方對(duì)α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加逐漸降低。配方對(duì)胰脂肪酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加先升高后降低，在羊棲菜水提物配比為450時(shí)達(dá)到最高。綜合分析確定羊棲菜水提物最佳配比為450。

如圖2B所示，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下，配方對(duì)α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低，在姜黃素配比為4時(shí)達(dá)到最高。配方對(duì)胰脂肪酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低，在姜黃素配比為6時(shí)達(dá)到最高；在姜黃素配比為4時(shí)，配方對(duì)胰脂肪酶活力抑制率也達(dá)到了較高水平。綜合分析后確定姜黃素最佳配比為4。

如圖2C所示，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下，配方對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率均隨著安石榴苷配比的增加先升高后降低，且均在安石榴苷配比為2時(shí)達(dá)到最高。因此確定安石榴苷最佳配比為2。

圖2 組分配比對(duì)配方α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力抑制率的影響Fig. 2 Effect of ratios of ingredients on the inhibition rate of α-glucosidase and pancreatic lipase activities by formulation

2.3 D優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以羊棲菜水提物配比（A）、姜黃素配比（B）和安石榴苷配比（C）為自變量，以α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率為響應(yīng)值，通過(guò)D優(yōu)化響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析，確定各成分最優(yōu)配比。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程，見(jiàn)式（2）、（3）。

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3）和可信度分析（表4）。由表3可知，對(duì)于α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率兩個(gè)響應(yīng)值，模型的P值均小于0.05，判斷模型顯著；模型失擬誤差P值均大于0.05，說(shuō)明模型失擬項(xiàng)不顯著。由表4可知，模型響應(yīng)值α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率的決定系數(shù)R2分別為0.99、0.94，校正后R2分別為0.97、0.82，表明模型擬合度高；模型的變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明模型對(duì)響應(yīng)值的置信度良好，該模型可以較好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜上所述，該回歸模型對(duì)響應(yīng)值的擬合程度較高，方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis of models

為更直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖分析。隨著羊棲菜水提物配比的增加，配方對(duì)α-葡萄糖苷酶活力抑制率先降低后升高；配方對(duì)α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨著姜黃素和安石榴苷配比的增加而升高（圖3A、B、C）。結(jié)合表3中三因素P值可知，三因素對(duì)配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率的影響力由高到低：羊棲菜水提物配比＞安石榴苷配比＞姜黃素配比。

圖3 配方組分配比對(duì)配方抑制α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig. 3 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of α-glucosidase activity by formulation

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

圖4是三因素之間的交互作用對(duì)配方抑制胰脂肪酶活力影響的響應(yīng)面圖。配方對(duì)胰脂肪酶活力的抑制率隨著羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比的增加先升高后降低；隨著姜黃素配比的增加而升高。結(jié)合表3中三因素P值可知，三因素對(duì)配方胰脂肪酶活力抑制率的影響力：姜黃素配比＞羊棲菜水提物配比＞安石榴苷配比。

圖4 配方組分配比對(duì)配方抑制胰脂肪酶活力的影響Fig. 4 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of pancreatic lipase activity by formulation

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最佳配方為：羊棲菜水提物配比150，姜黃素配比6，安石榴苷配比3；相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)α-葡萄糖苷酶活力抑制率為45.98%，胰脂肪酶活力抑制率為73.88%。選取預(yù)測(cè)所得的最佳配比進(jìn)行復(fù)配，測(cè)定復(fù)配配方對(duì)這兩種酶活力的抑制率。配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率為（47.77±2.15）%，胰脂肪酶活力抑制率為（74.18±0.46）%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)配方最佳配比。因此，最佳配比為m（羊棲菜水提物）∶m（姜黃素）∶m（安石榴苷）＝150∶6∶3。測(cè)定配方體外酶活力抑制效果，配方對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為（0.56±0.04）mg/mL和（0.210 0±0.000 3）mg/mL，優(yōu)于羊棲菜水提物單一成分。說(shuō)明以羊棲菜水提物為主，復(fù)配以姜黃素、安石榴苷之后，體外抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的能力得到了很大提高。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，配方組分羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷均對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力有較好的抑制作用。汪財(cái)生等[29]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜中的巖藻黃質(zhì)提取物可顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)，具有良好的減肥作用。本研究中羊棲菜水提物對(duì)胰脂肪酶活力的IC50為（1.02±0.02）mg/mL，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的輔助降血脂能力。王令充等[30]研究表明姜黃素可以顯著降低血清和肝臟中的膽固醇含量。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)兩種糖脂代謝酶（α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶）活力均具有較好的抑制活力，IC50分別為（0.730 0±0.018 6）mg/mL和（0.740 0±0.028 6）mg/mL。相比之下，3 種成分中安石榴苷的酶活力抑制效果最優(yōu)，對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為（0.420 0±0.001 3）mg/mL和（0.090 0±0.010 9）mg/mL，說(shuō)明安石榴苷具有較強(qiáng)的降血糖、降血脂活性。3 種成分均具有開(kāi)發(fā)成為輔助減肥、降糖降脂保健食品的潛力。

利用上述3 種活性成分，以海藻水提物為主，果蔬提取物為輔進(jìn)行復(fù)配，設(shè)計(jì)綠色健康的食品配方，有助于控制血糖、血脂以及減少相關(guān)并發(fā)癥的出現(xiàn)，達(dá)到輔助降糖降脂的目的，還可以促進(jìn)對(duì)藻類的開(kāi)發(fā)利用。以三者對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果IC50為判別依據(jù)，以配方對(duì)兩種酶活力的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和D優(yōu)化響應(yīng)面法最終確定了海藻果蔬配方最佳配比：m（羊棲菜水提物）∶m（姜黃素）∶m（安石榴苷）＝150∶6∶3。該配方體外對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別為（0.56±0.04）mg/mL和（0.210 0±0.000 3）mg/mL。將姜黃素和安石榴苷與羊棲菜水提物復(fù)配后，對(duì)α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果優(yōu)于單一成分羊棲菜水提物。此配方原料均為海藻、果蔬的天然產(chǎn)物，安全無(wú)毒、無(wú)害。

雖然本研究?jī)?yōu)化得到的海藻果蔬提取物復(fù)配最佳配方在體外有良好的輔助降糖降脂的效果，但其體內(nèi)輔助降糖降脂效果及作用機(jī)理有待進(jìn)一步探討。并且本研究中的配方組分均是從植物中分離提取的純度高的成分，不是食品原料，不能直接用于保健食品。因此，符合保健食品規(guī)格的輔助降糖降脂配方還需在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。